Stabilizzazione epatocellulare Fenotipo Utilizzando superfici sintetiche ottimizzati
Summary
Questo articolo si concentrerà sullo sviluppo di superfici polimeriche rivestite a lungo termine, coltura stabile di cellule staminali derivate epatociti umani.
Abstract
Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.
Introduction
I materiali biologici sono stati ampiamente utilizzati per la manutenzione e la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti 1. Mentre permettendo, questi substrati biologici spesso contengono una miriade di componenti non definiti. Matrigel è un substrato comunemente usato per la cultura e la differenziazione delle cellule staminali. Purtroppo, la sua composizione variabile influenza la funzione delle cellule e fenotipo. Anche se una serie di matrici biologiche alternative, più definite sono state utilizzate 2-7, la loro origine animale o scarsa scalabilità li rende i candidati non idonei per la produzione industriale. Pertanto, l'individuazione di alternative sintetiche, a composizione definita e prestazioni affidabili, sono obiettivi chiave nella ricerca sulle cellule staminali.
Nel tentativo di superare i limiti dei indefiniti substrati di coltura cellulare, collaborazioni interdisciplinari tra chimica e biologia hanno identificato materiali sintetici con la capacità di supportare fenotipo cellulare. Synthsubstrati ETIC sono scalabili, economiche, e possono essere realizzati in strutture 3D complesse, mimando l'ambiente in vivo. Grazie a queste proprietà substrati sintetici sono stati ampiamente utilizzati per sostenere e guidare la differenziazione di molti tipi di cellule 8-10.
Test di throughput avanzate e alte hanno facilitato la rapida proiezione di materiali sintetici, dai grandi librerie, e consegnati nuovi materiali con proprietà flessibili con ampie applicazioni nella ricerca e nello sviluppo 11-13 biomedico. Utilizzando un elevato throughput, polimero tecnologia di screening micro-array, abbiamo rapidamente identificato un semplice poliuretano (PU134), adatto per la manutenzione di cellule staminali derivate epatociti umani. Questo polimero è risultato essere superiore a substrati derivati di origine animale per quanto riguarda la differenziazione e la funzione 14-16 epatociti. Abbiamo quindi ottimizzato il processo di rivestimento in condizioni, la topografia e la sterilizzazione per accedere effettisulle prestazioni del polimero nella stabilizzazione funzione degli epatociti e la durata della vita. Ciò ha implicazioni significative per quanto riguarda la comprensione fondamenti della biologia degli epatociti per la modellazione basata su cellule e applicazioni di medicina rigenerativa.
La tecnologia qui descritta costituisce un esempio di come la superficie di un polimero sintetico può essere ottimizzato per preservare fenotipo cellulare. Crediamo che la combinazione di questa tecnologia con un protocollo di differenziazione degli epatociti privo di siero efficace ha il potenziale per fornire una produzione scalabile di epatociti per l'utilizzo nella modellazione in vitro e della medicina rigenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molti dei metodi attualmente utilizzati per generare epatociti da cellule staminali si basano su matrici indefinite di origine animale. Questi supporti possono essere costosi e molto variabile, che colpisce la funzione delle cellule e la stabilità, che rappresentano una barriera significativa applicazione. Pertanto, abbiamo effettuato una schermata per materiali sintetici che supportano la cultura di cellule staminali epatociti derivati. Abbiamo identificato, un semplice poliuretano (PU134), formata da polimerizzazione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DCH, MB e FK sono stati sostenuti da un EPSRC Segui su Fund. BL-V e DS sono stati supportati da ogni MRC borse di dottorato di ricerca. KC è stato sostenuto da un finanziamento della piattaforma di Medicina Rigenerativa Regno Unito.
Materials
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 |
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