ייצוב Hepatocellular הפנוטיפ באמצעות משטחים סינטטיים אופטימליים
Summary
מאמר זה יתמקד בפיתוח משטחים מצופים פולימר לטווח ארוך, תרבות היציבה של תאי גזע המופקת hepatocytes האנושי.
Abstract
Currently, one of the major limitations in cell biology is maintaining differentiated cell phenotype. Biological matrices are commonly used for culturing and maintaining primary and pluripotent stem cell derived hepatocytes. While biological matrices are useful, they permit short term culture of hepatocytes, limiting their widespread application. We have attempted to overcome the limitations using a synthetic polymer coating. Polymers represent one of the broadest classes of biomaterials and possess a wide range of mechanical, physical and chemical properties, which can be fine-tuned for purpose. Importantly, such materials can be scaled to quality assured standards and display batch-to-batch consistency. This is essential if cells are to be expanded for high through-put screening in the pharmaceutical testing industry or for cellular based therapy. Polyurethanes (PUs) are one group of materials that have shown promise in cell culture. Our recent progress in optimizing a polyurethane coated surface, for long-term culture of human hepatocytes displaying stable phenotype, is presented and discussed.
Introduction
חומרים ביולוגיים היו בשימוש נרחב בתחזוקה וההתמיינות של תאי גזע pluripotent 1. תוך שהוא מאפשר, מצעים ביולוגיים אלה לעתים קרובות מכילים מספר עצום של מרכיבים בלתי מוגדרים. Matrigel הוא מצע נפוץ לתרבית תאי גזע ובידול. לרוע המזל, ההרכב משתנה משפיע על תפקוד תא ופנוטיפ. למרות מגוון רחב של מטריצות חלופיות, מוגדרות יותר ביולוגיות היה בשימוש 2-7, מן החי או מן מדרגיות עניים שלהם הופכת אותם למועמדים שאינם מתאימים לייצור תעשייתי. לכן זיהוי של חלופות סינתטיות, עם הרכב מוגדר וביצועים אמין, הן מטרות מרכזיות במחקר בתאי גזע.
בניסיון להתגבר על המגבלות של מצעי תרבית תאים לא מוגדרים, שיתופי פעולה בין תחומיים בין הכימיה והביולוגיה זיהו חומרים סינטטיים עם היכולת לתמוך בפנוטיפ תא. Synthמצעי etic הם ניתנים להרחבה, חסכוניים, ויכולים להיות מיוצרים לתוך מבנים מורכבים 3D, מחקה את סביבת in vivo. בשל מאפיינים אלה מצעים סינטטיים היו בשימוש נרחב כדי לתמוך ולהוביל בידול של סוגי תאים רבים 8-10.
מבחני תפוקה מתקדמים וגבוהים הקלו סינון המהיר של חומרים סינטטיים, מספריות גדולות, ונמסרו חומרים חדשים בעלי תכונות גמישות עם יישומים רחבים במחקר ופיתוח ביו 11-13. ניצול תפוקה גבוהה, טכנולוגית הקרנת מיקרו מערך פולימר, אנו במהירות זיהינו פוליאוריטן פשוט (PU134), מתאים לתחזוקה של תאים כבדים בתאי גזע אנושיים נגזרים. פולימר זה נמצא להיות עדיף על מצעים מן החי בנוגע לבידול hepatocyte ותפקוד 14-16. לאחר מכן יש לנו אופטימיזציה תהליך תנאי ציפוי, הטופוגרפיה ועיקור כדי לגשת להשפעותעל ביצועי פולימרים בייצוב תפקוד הפטוציט ותוחלת חיים. יש לכך השלכות משמעותיות בכל קשור להבנת יסודות הביולוגיה הפטוציט לדוגמנות תא מבוססת ויישומי רפואה רגנרטיבית.
הטכנולוגיה שתוארה כאן מייצגת דוגמא לאופן שעל פני השטח של פולימר סינטטי יכול להיות מותאמים כדי לשמר את הפנוטיפ של תאים. אנו מאמינים כי שילוב של טכנולוגיה זו עם פרוטוקול בידול hepatocyte סרום ללא יעיל יש את הפוטנציאל לספק ייצור להרחבה של תאים כבדים לשימוש במודלים במבחנה ורפואת רגנרטיבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
רבים מהשיטות הנוכחיות משמשות ליצירת תאים כבדים מתאי גזע להסתמך על מטריצות מוגדרות מן החי. מצעים אלה יכולים להיות יקרים ומשתנים מאוד, המשפיעים על תפקוד תא ויציבות, המייצג חסם משמעותי ליישום. לכן, ביצענו מסך לחומרים סינטטיים התומכים בתרבות של תאים כבדים שמקורן בתאי גז?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DCH, MB וFK נתמכו על ידי מעקב EPSRC על קרן. BL-V וDS היו כל נתמך על ידי תעודת סטודנט לתואר שלישי MRC. KC נתמכה על ידי מימון מבריטניה רפואת רגנרטיבית הפלטפורמה.
Materials
| Synthesis, preparation, coating and characterization of polymer PU134 coated coverslips | |||
| Shaker | Edmun Bühler | KS-15 | |
| Irradiator | CIS Biointernational | IBL 637 | |
| Spin coater | Specialty Coating System | P-6708 | |
| Scanning Electron Microscope | Philips | XL30CPSEM | |
| Atomic Force Microscope | DimensionV Nanoscope, VEECO | ||
| p4-GLO CYP3A4 | Promega | V8902 | |
| UV bulb | ESCO | ||
| NanoScope analysis software | VEECO | version 1.20 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | TH45200 | Use Volocity 4 Software |
| Tissue culture plates | Corning, UK | 3527 | |
| glass slides | Scientific Laboratory Supplies | MIC3308 | |
| Diethylene glycol | Sigma–Aldrich | 93171 | |
| 1,6-hexanediol | Sigma–Aldrich | 240117 | |
| Neopentyl glycol | Sigma–Aldrich | 408255 | |
| Adipic acid | Sigma–Aldrich | 9582 | |
| anhydrous N,N-Dimethylformamide | Sigma–Aldrich | 227056 | |
| Diethyl ether | Sigma–Aldrich | 676845 | |
| titanium (IV) butoxide | Sigma–Aldrich | 244112 | |
| 1,4-butanediol | Sigma–Aldrich | 493732 | |
| Vacuum oven | Thermoscientific | ||
| 4,4’-Methylenebis(phenyl isocyanate) | Sigma–Aldrich | 101688 | |
| Tetrahydrofurane | Sigma–Aldrich | 401757 | |
| Sputter coater | Bal-Tec SCD 050 | ||
| Inmunostaining | |||
| Phosphate buffer saline (-MgCl2, -CaCl2) | Gibco | 10010031 | Store at room temperature |
| PBST, PBS made up with 0.1% TWEEN 20 | Scientific Laboratory Supplies Ltd | EC607 | |
| Methanol | Scientific Laboratory Supplies Ltd | CHE5010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, UK | A7906 | |
| MOWIOL 488 DAPI | Calbiochem | 475904 | Made up in Tris HCL and glycerol as per manufacturers instructions |
| Cell culture and Functional assay | |||
| CYP3A activity pGLO kit | Promega | V8902 | |
| Hepatozyme | Gibco | 17705021 | |
| TryLE express | Life Technologies | 12604013 |
References
- Zhou, W., et al. SUMOylation of HNF4α regulates protein stability and hepatocyte function. J Cell Sci. 125 (15), 3630-3635 (2012).
- Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
- Shanbhag, M. S., et al. Neural Progenitor Cells Grown on Hydrogel Surfaces Respond to the Product of the Transgene of Encapsulated Genetically Engineered Fibroblasts. Biomacromolecules. 11 (11), 2936-2943 (2010).
- Battista, S., et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation. Biomaterials. 26 (31), 6194-6207 (2005).
- Tian, W. M., et al. Hyaluronic acid hydrogel as Nogo-66 receptor antibody delivery system for the repairing of injured rat brain: in vitro. Journal of Controlled Release. 102 (1), 13-22 (2005).
- Keshaw, H., Forbes, A., Day, R. M. Release of angiogenic growth factors from cells encapsulated in alginate beads with bioactive glass. Biomaterials. 26 (19), 4171-4179 (2005).
- Baharvand, H., Hashemi, S. M., Kazemi Ashtiani, S., Farrokhi, A. Differentiation of human embryonic stem cells into hepatocytes in 2D and 3D culture systems in vitro. The International Journal of Developmental Biology. 50 (7), 645-652 (2006).
- Cameron, K., Travers, P., Chander, C., Buckland, T., Campion, C., Noble, B. Directed osteogenic differentiation of human mesenchymal stem/precursor cells on silicate substituted calcium phosphate. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 101 (1), 13-22 (2013).
- Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3 (3), 034112 (2008).
- Li, Z., Guo, X., Matsushita, S., Guan, J. Differentiation of cardiosphere-derived cells into a mature cardiac lineage using biodegradable poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Biomaterials. 32 (12), 3220-3232 (2011).
- Tare, R. S., Khan, F., Tourniaire, G., Morgan, S. M., Bradley, M., Oreffo, R. O. C. A microarray approach to the identification of polyurethanes for the isolation of human skeletal progenitor cells and augmentation of skeletal cell growth. Biomaterials. 30 (6), 1045-1055 (2009).
- Khan, F., Tare, R. S., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C., Bradley, M. Strategies for cell manipulation and skeletal tissue engineering using high-throughput polymer blend formulation and microarray techniques. Biomaterials. 31 (8), 2216-2228 (2010).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nature Communications. 4 (1335), (2013).
- Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
- Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
- Lucendo-Villarin, B., Khan, F., Pernagallo, S., Bradley, M., Iredale, J. P., Hay, D. C. Maintaining hepatic stem cell gene expression on biological and synthetic substrata. BioResearch Open Access. 1 (1), 50-53 (2012).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (34), 12301-12306 (2008).
- Szkolnicka, D., Zhou, W., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell–Derived Hepatocytes: Potential and Challenges in Pharmacology. Annu Rev Pharmecol Toxicol. 53, 147-149 (2013).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
- Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Culture of organized cell communities. Advanced Drug Delivery Reviews. 33 (1-2), 15-30 (1998).
- Braam, S. R., et al. Recombinant Vitronectin Is a Functionally Defined Substrate That Supports Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal via αVβ5 Integrin. Stem Cells. 26 (9), 2257-2265 (2008).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5 (3195), (2014).
- Thaburet, J. -. F. O., Mizomoto, H., Bradley, M. High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries. Macromolecular Rapid Communication. 25 (1), 336-370 (2003).
- Lim, J. Y., Donahue, H. J. Cell Sensing and Response to Micro- and Nanostructured Surfaces Produced by Chemical and Topographic Patterning. Tissue Engineering. 13 (8), 1879-1891 (2007).
- Teixeira, A. I., Abrams, G. A., Bertics, P. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Epithelial contact guidance on well-defined micro- and nanostructured substrates. Journal of Cell Science. 116 (10), 1881-1892 (2003).
- Biggs, M. J. P., Richards, R. G., Wilkinson, C. D. W., Dalby, M. J. Focal adhesion interactions with topographical structures: a novel method for immuno-SEM labelling of focal adhesions in S-phase cells. Journal of Microscopy. 231 (1), 28-37 (2008).
- Karuri, N. W., Porri, T. J., Albrecht, R. M., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Nano- and microscale holes modulate cell-substrate adhesion, cytoskeletal organization, and -beta1 integrin localization in SV40 human corneal epithelial cells. IEEE Transactions on Nanobioscience. 5 (4), 273-280 (2006).
- Hamilton, D. W., Brunette, D. M. The effect of substratum topography on osteoblast adhesion mediated signal transduction and phosphorylation. Biomaterials. 28 (1), 1806-1819 (2007).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dang, J. M., Leong, K. W. Myogenic Induction of Aligned Mesenchymal Stem Cell Sheets by Culture on Thermally Responsive Electrospun Nanofibers. Advanced Materials. 19 (19), 2775-2779 (2007).
- Azevedo, E. C., Nascimento, E. M., Chierice, G. O. UV and gamma irradiation effects on surface properties of polyurethane derivate from castor oil. Polímeros. 23 (3), 305-311 (2013).
- Rosu, L., Cascaval, C. N., Ciobanu, C., Rosu, D. Effect of UV radiation on the semi-interpenetrating polymer networks based on polyurethane and epoxy maleate of bisphenol A. Journal of Photochemistry and Photobilogy A: Chemistry. 169 (2), 177-185 (2005).
- Yang, X. F., Tallman, D. E., Bierwagen, G. P., Croll, S. G. Blistering and degradation of polyurethane coatings under different accelerated weathering tests. Polymer Degradation and Stability. 77 (1), 103-109 (2002).
