Цельноклеточная Записи патч-зажим от Morphologically- и нейрохимически выявленных гиппокампа Интернейроны
Summary
Кортикальные сети контролируется небольшой, но разнообразный набор тормозных интернейронов. Функциональное исследование интернейронов поэтому требуется целенаправленное запись и строгий идентификацию. Описанный здесь является комбинированный подход с участием цельноклеточная записи из одной или синаптически-связанных пар нейронов с внутриклеточным маркировка, ретроспективный морфологический и иммуноцитохимического анализа.
Abstract
ГАМКергические тормозных интернейронов играть центральную роль в нейронных цепях мозга. Интернейроны содержать небольшое подмножество нейронов населения (10-20%), но показать высокий уровень физиологической, морфологической и нейрохимические неоднородности, отражающие их разнообразные функции. Поэтому исследование интернейронов содержит важную информацию о принципах организации и функционирования нейронных цепей. Это, однако, требует комплексного физиологического и нейроанатомической подход к выбору и идентификации отдельных типов интернейронов. Весь-клеток патч-зажим записи с острыми срезах мозга трансгенных животных, экспрессирующих флуоресцентные белки по промоторов интернейронов-специфических маркеров, обеспечивает эффективный способ целевому и электрофизиологически характеризуют внутренние и синаптические свойства определенных типов интернейронов. В сочетании с маркировки внутриклеточного красителя, этот подход может быть расширен с пост-специальной месrphological и иммуноцитохимический анализ, что позволяет систематическое определение записанных нейронов. Эти методы могут быть адаптированы в соответствии широкий спектр научных вопросов, касающихся функциональных свойств различных типов нейронов коры.
Introduction
Гиппокампа нейронов схемы уже давно предметом пристального внимания, как по отношению к анатомии и физиологии, в связи с их важной роли в процессах обучения и памяти, а также пространственной навигации у человека и грызунов. Равным образом, заметным, но просто ламинарного организация гиппокампа делает этот регион любимым предметом исследований, посвященных структурные и функциональные свойства коры сетей.
Гиппокампа схемы состоят из возбуждающих главных клеток (> 80%) и в меньшей (10-20%), но весьма разнообразной когорте тормозных интернейронов 1-3. Интернейроны выпустить γ-аминомасляной кислоты (ГАМК) от их аксонов, которая действует на быстро ионотропных рецепторов ГАМК А (ГАМК RS) и медленные метаботропные ГАМК B рецепторами (ГАМК B RS) 4. Эти ингибирующие механизмы противовеса возбуждение и регулируют возбудимость главных клеток, и, таким образомИК сроки и структура разряда. Тем не менее, ГАМК освобожден от интернейронов действует не только на главных клетках, но и на самих 5,6 интернейронов. До и постсинаптические рецепторы обеспечивают регулирование обратной связи и ингибирующие взаимных взаимодействий между различными типами интернейрон. Эти ингибирующие механизмы интернейронных сетей, как полагают, центральное место в генерации и формирования паттернов активности населения, в частности колебаний на разных частотах 7.
Цельноклеточная записи патч-зажим является хорошо признанным методом для исследования внутренних свойств и синаптических взаимодействий нейронов. Тем не менее, в связи с большим разнообразием типов интернейронов, исследование тормозных интернейронов требует строгого идентификации записанных клеток. Как гиппокампа типы интернейронов характеризуются различными морфологическими особенностями и нейрохимические экспрессии маркеров, в сочетании анатомических и иммуноцитохимического еxamination может служить средством для определения точного 6,8,9 интернейрон, удостоверяющий личность.
В настоящей работе мы описываем экспериментальный подход, в котором цельноклеточные записи патч-зажим от отдельных нейронов или синаптически-связанных пар в сочетании с внутриклеточной маркировки, а затем после специальной морфологического и иммуногистохимического анализа, что позволяет для характеристики медленного ГАМК B рецепторов опосредовано ингибирующие эффекты в определенных интернейронов. В качестве примера, мы ориентируемся на одного крупного типа интернейронов, подмножества так называемых «корзину клеток" (до нашей эры), который иннервирует сомы и проксимальных дендритов своих постсинаптических целей и характеризуется «быстрой пики" (FS) выполнять узор, аксон плотно закрывающую слой тела клеток и экспрессию белка парвальбумина кальция связывания (PV) 10,11. Эти интернейронов отображения больших постсинаптические ингибирующие токов, а также заметную предварительносинаптической модуляция их синаптической выходе, в ответ на ГАМК B R активации 12. Сочетание методов, описанных здесь, могут быть применены в равной степени, чтобы исследовать внутренние механизмы или синаптические в различных других определенных типов нейронов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы опишем метод, который сочетает электрофизиологические и нейроанатомической методы функционально охарактеризовать morphologically- и нейрохимически-выявленных нейронов в пробирке; в частности, различные виды корковых тормозных модулей. Ключевые аспекты процедуры являются: (1) предварите?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Ina Вольтер за отличную техническую помощь. VGAT-Венера трансгенные крысы были получены докторами. Ю. Янагава, М. Hirabayashi и Y. Кавагути в Национальном институте физиологических наук, Окадзаки, Япония, используя PCS2-Венера, предоставленную д-ра А. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
References
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
