De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés
Summary
Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique.
Abstract
Interneurones inhibiteurs GABAergiques jouent un rôle central dans les circuits neuronaux du cerveau. Interneurones comprennent un petit sous-ensemble de la population neuronale (10-20%), mais montrent une grande hétérogénéité physiologique, morphologique et neurochimique, reflétant leurs diverses fonctions. Par conséquent, l'enquête des interneurones fournit des renseignements importants sur les principes de l'organisation et de la fonction des circuits neuronaux. Ceci, cependant, nécessite une approche physiologique et neuro-anatomique intégré pour la sélection et l'identification des types individuels des interneurones. Cellules entières d'enregistrement de tranches de cerveau aiguës d'animaux transgéniques, exprimant des protéines fluorescentes dans les promoteurs de marqueurs spécifiques d'interneurones patch-clamp, fournit une méthode efficace pour cibler et électrophysiologique caractériser les propriétés intrinsèques et synaptiques des types des interneurones spécifiques. Combiné avec intracellulaire étiquetage de colorant, cette approche peut être étendue avec post-hoc moanalyse rphological et immunocytochimique, permettant une identification systématique des neurones enregistrés. Ces méthodes peuvent être adaptés à un large éventail de questions scientifiques concernant les propriétés fonctionnelles des divers types de neurones corticaux.
Introduction
Circuits neuronaux de l'hippocampe ont longtemps fait l'objet d'un examen minutieux, par rapport à l'anatomie et de la physiologie, en raison de leur rôle essentiel dans l'apprentissage et la mémoire, ainsi que la navigation spatiale chez les humains et les rongeurs. De même, l'organisation laminaire de premier plan, mais simplement de l'hippocampe fait de cette région un sujet de prédilection des études portant sur les propriétés structurales et fonctionnelles des réseaux corticaux.
Circuits de l'hippocampe sont constitués de cellules excitateurs principaux (> 80%) et un plus petit (10-20%), mais la cohorte très diversifié d'interneurones inhibiteurs 1-3. Interneurones libèrent de l'acide γ-aminobutyrique (GABA) de leurs terminaux des axones qui agit à ionotropes rapide récepteurs GABA A (GABA A R) et lents métabotropiques GABAB récepteurs GABA (B R) 4. Ces mécanismes inhibiteurs contrebalancer excitation et de réguler l'excitabilité des cellules principales, et donc lamoment de ir et le modèle de décharge. Cependant, les interneurones GABA libéré agit non seulement sur les cellules principales, mais également sur les interneurones 5,6 eux-mêmes. Récepteurs post-synaptiques et pré médiation régulation par rétroaction et interactions mutuelles inhibitrices entre les différents types de interneurones. Ces mécanismes inhibiteurs dans les réseaux des interneurones sont soupçonnés d'être au cœur de la production et la mise en forme des modèles d'activité de la population, en particulier les oscillations à des fréquences différentes 7.
Cellule entière enregistrement patch-clamp est une méthode bien établie pour l'examen des propriétés intrinsèques et les interactions synaptiques des neurones. Toutefois, en raison de la grande diversité des types de interneurones, enquête sur les interneurones inhibiteurs exige l'identification rigoureuse des cellules enregistrées. Comme types de interneurones hippocampiques sont caractérisés par des éléments particuliers morphologiques et l'expression du marqueur neurochimique, anatomique combinée et immunocytochimique eXAMEN peut fournir un moyen de déterminer précisément 6,8,9 identité des interneurones.
Dans le présent article, nous décrivons une approche expérimentale dans laquelle des cellules entières enregistrements de patch-clamp de neurones simples ou paires synaptique couplés sont combinés avec marquage intracellulaire, suivie par analyse post-hoc morphologique et immunocytochimique, permettant la caractérisation de la lenteur GABA B médiée par le récepteur des effets inhibiteurs dans les interneurones identifiés. A titre d'exemple, nous nous concentrons sur un type majeur de interneurones, un sous-ensemble de ce qu'on appelle les «cellules de panier" (de la Colombie-Britannique), qui innerve les soma et proximale des dendrites de ses objectifs post-synaptiques et se caractérise par un "dopage rapide» (FS) décharger motif, recouvrant un axone forte densité de la couche de corps de la cellule, et l'expression de la protéine parvalbumine de liaison du calcium (PV) 10,11. Ces interneurones présentent d'importants courants postsynaptiques inhibiteurs, ainsi que des pré proéminentmodulation synaptique de leur sortie synaptique, en réponse à l'activation GABA B R 12. La combinaison des techniques décrites ici peut être appliqué aussi bien pour étudier les mécanismes intrinsèques ou synaptiques dans une variété d'autres types de neurones identifiés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons une méthode qui combine des techniques de neuro-anatomiques et électrophysiologiques à la caractérisation fonctionnelle des neurones morphologically- et neurochimique identifiés in vitro; notamment les divers types de IN inhibiteurs corticaux. Les principaux aspects de la procédure sont les suivantes: (1) pré-sélection des potentiels IN; (2) l'enregistrement intracellulaire et le neurone visualisation; et enfin (3) l'analyse morphologique et immunocytochimique de IN enregistrées. Bien qu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Ina Wolter pour son excellente assistance technique. VGAT-Vénus rats transgéniques ont été générées par les Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi et Y. Kawaguchi à l'Institut national de sciences physiologiques, Okazaki, Japon, utilisant pCS2-Vénus fourni par le Dr A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
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