MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi
Summary
Uçuşu (MALDI-TOF) kütle spektrometresi (MS), doğrudan kan kültür çorbasına matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman uygulanması bakteri tanımlanmasını hızlandırır. Sunulan yöntemi doğrudan kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin tanımlanması için hızlı ve güvenilir bir yöntemdir.
Abstract
Klinik mikrobiyoloji laboratuvarında önemli bir rol kan dolaşımı enfeksiyonu neden bakterilerin hızlı bir şekilde tanınmasını sağlamaktır. Geleneksel kimlik sadece olgunlaşmış katı agar kolonileri sonra geçerli bir kimlik belgesi ile sinyalize kan kültür sıvısının alt-kültürü gerektiriyor. MALDI-TOF MS katı ortam üzerinde koloniler uygulanan klinik olarak ilgili bakterilerin çoğunluğunun belirlenmesi için güvenilir ve hızlı bir yöntemdir. Bu bakteri türlerinin belirlenmesi hızlandırmak ve klinik yönetimini geliştirmek için bir potansiyele sahip olarak doğrudan kan kültür çorbasına MALDI-TOF MS uygulaması çekici bir yaklaşımdır. Bununla birlikte, üstesinden gelmek için önemli bir sorun kaldırılmaz ise, MS spektrumları müdahale ve yetersiz ya da düşük ayrımcılık kimlik puan neden olabilir, kan kültürü örneklerinde içerdiği müdahale reçineler, protein ve hemoglobin ön analiz çıkarılmasıdır. Buna ek olarak Bacter konsantre gereklidiria yeterli kalitede spektrumları geliştirmektir. Sunulan yöntem olup, konsantrasyon, arıtma ve bir işaret kan kültürü sıvısından bakterilerin erken tespiti için izin Gram negatif bakterilerin çıkarılması açıklanmaktadır.
Introduction
Nedeniyle bakterilere kan dolaşımı enfeksiyonu (BSI) olan hastalar 6-48% 1 arasında değişen, yüksek hastane içi mortalite devam etmektedir. Uygun ampirik antibiyotik teslim hayatta teşvik ve ağır sepsis hastalarının alt kümesi, uygun tedaviye her saat gecikme sağkalım 2,3 azalmış ilişkilidir. Buna göre, klinik laboratuvar önemli bir hedefi hızla saptamak, tanımlamak ve klinik kararlarını bildirmek için kan kültürlerinde bakteri varlığını iletişim kurmaktır. Bu mikrobiyoloji laboratuvar son zamanlarda Gram leke 4 raporlanması ve zamanında antimikrobiyal tedavinin üzerinde en büyük etkiye sahip olduğu kanıtlanmıştır, gözlemsel bir çalışma göstermiştir ki, uçuş kütle spektrometresi matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon süresi (MALDI-TOF MS) kan kültür sıvılarında doğrudan uygulanan Gram negatif bakterilerin 5 neden BSI üçte biri reçeteleme etkileyebilir.
<p class="Jove_content"> MALDI-TOF MS ticari gelişimi 6,7 mikroorganizmaların tespit edilmesi için etkili bir laboratuar aracı yol açmıştır. Teknoloji artık iyi kurulmuş ve katı ortamlar 6,8 izole mikroorganizmaların hızlı ve doğru tanımlanması için pek çok laboratuvarda entegre edilmiştir. Kan kültürü çünkü düşük maliyetle mikroorganizmaların önceki bir kimlik elde etmek için potansiyeli hem klinisyen ve laboratuvar yöneticileri için mikroorganizmalar temyiz için "olumlu" sinyalini (BC) suyu MALDI-TOF MS doğrudan uygulama.Gram negatif bakteriler arasında değişen başarıyla tespit raporları ile kimlik standart fenotipik kültürü bazlı yöntemler ile karşılaştırıldığında kan kültürü suyu için MALDI-TOF MS doğrudan uygulama klinik yarar görülmüştür hassasiyetleri geniş ile sınırlı olmuştur 47-98,9 % 9-11. Duyarlığındaki farklılaşmaya muhtemelBC suyu bileşim, başlangıç bakteri konsantrasyonu, numune hazırlama yöntemi değişkenlik hem de çalışma popülasyonları 9 karşılaşılan Gram negatif organizmaların dizisine ilişkindir. Bu yayınlanmış protokoller ile karşılaştırıldığında Burada yer alan yöntem, etanol, amonyum klorür ya da ek (non-matrix) asetonitril kullanımını önler. Bunun bir sonucu olarak, bakteri peleti potansiyel fenotipik duyarlılık testi yöntemleri suyu içinde, bu organizmalar için direkt olarak uygulanabilir için izin (protein ekstraksiyon noktaya kadar) uygun bir kalır. Buna ek olarak, sunulan yöntem, pahalı olmayan, güvenilir ve süre 12 'eller' minimal ile kan kültürü Gram leke sonuç 25 dakika içinde mevcut bakteriyel tanımlama ile hızlı olduğu gösterilmiştir.
Bu yöntem, Gram negatif b tanımlamak için pozitif kan kültür sıvılarında doğrudan uygulanan formik asit çıkarma kullanan basit bir in-house spin-parçalama protokoldürMALDI-TOF MS teknolojisi ile Ancak bakteriler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Santrifüj sonrası adımlar ayrılmış eser bileşenler için değil, yeterli bakım ile gerçekleştirilen bir kan kültürü suyu için MALDI-TOF MS uygularken önemlidir. Bu, MALDI-TOF spektrumları ile müdahale sivri üretebilir hemoglobin da dahil olmak üzere kan kültürü bileşenleri ve insan hücresel proteinleri, kaldırmak için özellikle önemlidir.
MS türler için ≥ 2.0 puan kesti ve cins tanımlanması için ≥ 1.7 tavsiye üretmektedir rağmen, diğer raporlar M.Ö. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod’hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
