La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas
Summary
La aplicación de láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas (MS) directamente a caldo de cultivo de sangre acelera la identificación de bacterias. El método presentado es un método rápido y fiable para la identificación de bacterias Gram negativas directamente desde el caldo de cultivo de sangre.
Abstract
Una función importante de los laboratorios de microbiología clínica es proporcionar una rápida identificación de bacterias causantes de infección del torrente sanguíneo. Identificación tradicional requiere la sub-cultura de la señalada caldo de cultivo de sangre con identificación disponible sólo después de colonias en agar sólido han madurado. MALDI-TOF MS es un método fiable, rápido para la identificación de la mayoría de bacterias clínicamente relevantes cuando se aplica a las colonias en medios sólidos. La aplicación de MALDI-TOF MS directamente al caldo de cultivo de sangre es un enfoque atractivo, ya que tiene el potencial de acelerar la identificación de especies de bacterias y mejorar la gestión clínica. Sin embargo, un problema importante a superar es la eliminación de pre-análisis de interferencia resinas, proteínas y hemoglobina contenidas en las muestras para cultivo de sangre que, si no se elimina, interfieren con los espectros de MS y puede resultar en las puntuaciones de identificación de discriminación insuficientes o bajos. Además, es necesario concentrar bacteria para desarrollar espectros de calidad suficiente. El método que se presenta describe la concentración, purificación y extracción de las bacterias Gram negativas que permitan la identificación temprana de las bacterias de un caldo de cultivo de sangre señalado.
Introduction
Los pacientes con infección del torrente sanguíneo (BSI), debido a las bacterias continúan teniendo una alta mortalidad en el hospital, que van 6-48% 1. La entrega de antibiótico empírico adecuado promueve la supervivencia y en el subconjunto de pacientes con sepsis grave, cada retardo horas a la terapia apropiada se correlaciona con una menor supervivencia 2,3. En consecuencia, un objetivo clave del laboratorio clínico es detectar rápidamente, identificar y comunicar la presencia de bacterias en cultivos de sangre para informar las decisiones clínicas. Se ha demostrado que el laboratorio de microbiología tiene la mayor influencia en la terapia antimicrobiana en el momento de la presentación de informes de la tinción de Gram 4 y, recientemente, un estudio observacional demostró que el tiempo de desorción por láser asistida por matriz / ionización de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) realizado directamente en caldos de cultivo de sangre influir en la prescripción en más de una tercera parte de BSI causadas por bacterias Gram negativas 5.
<p class="Jove_content"> El desarrollo comercial de MALDI-TOF MS ha llevado a una herramienta de laboratorio eficaz para la identificación de microorganismos 6,7. La tecnología está ahora bien establecida y se ha integrado en muchos laboratorios para la identificación rápida y precisa de los microorganismos aislados en el 6,8 medios sólidos. La aplicación directa de MALDI-TOF MS para hemocultivo (BC) de caldo que se han señalado "positivo" para los microorganismos apela a los médicos y directores de laboratorio debido a la posibilidad de obtener una identificación más temprana de los microorganismos a bajo costo.La utilidad clínica de la aplicación directa de MALDI-TOF MS de caldo de cultivo de sangre ha sido limitado por la amplia gama de sensibilidades observados cuando se compara con los métodos basados en la cultura fenotípica estándar de identificación, con los informes de la identificación con éxito de las bacterias Gram negativas que van desde 47 hasta 98,9 9-11%. La variación en la sensibilidad probablese refiere a la composición antes de Cristo caldo, la concentración bacteriana inicial, la variación en los métodos de preparación de muestras, así como la gama de organismos Gram negativos encontrados en las poblaciones de estudio 9. En comparación con estos otros protocolos publicados el método presentado aquí evita el uso de etanol, cloruro de amonio o (no-matriz) acetonitrilo adicional. Como resultado, el sedimento bacteriano se permanecer viable (hasta el punto de extracción de la proteína) que permite métodos potenciales de prueba de susceptibilidad fenotípica a ser aplicados directamente a estos organismos en el caldo. Además, el método que se presenta se ha demostrado para ser de bajo costo, confiable y rápida con la identificación de bacterias disponibles dentro de 25 min de los hemocultivos Gram resultados de la tinción, con un mínimo de "manos en" el tiempo 12.
Este método es un simple protocolo de spin-lisis de la casa utilizando la extracción con ácido fórmico aplicado directamente a los caldos de cultivo de sangre positivo para identificar Gram negativo bacteria con la tecnología MALDI-TOF MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es importante aplicar el MALDI-TOF MS de caldo de cultivo de sangre que los pasos posteriores a la centrifugación se llevan a cabo con el cuidado suficiente para no volver a mezclar los componentes separados. Es particularmente importante para eliminar los constituyentes de cultivos de sangre y proteínas celulares humanos, incluyendo la hemoglobina, que pueden producir picos de interferencia con los espectros de MALDI-TOF.
Aunque MS fabrica recomendar cortar de puntuación de ≥ 2,0 para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
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