Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии
Summary
Применение матрицы-лазерной десорбцией / время ионизации полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии (MS) непосредственно к культуре крови бульона ускоряет идентификацию бактерий. Представленный метод является быстрым и надежным методом идентификации грамотрицательных бактерий непосредственно из культуры крови бульоне.
Abstract
Важную роль в клинической лаборатории микробиологии является обеспечение быстрой идентификации бактерий, вызывающих инфекции кровотока. Традиционный идентификация требует суб-культуру сигнальное культуры крови бульоне с идентификации доступных только после колоний на твердой агар созрели. MALDI-TOF MS является надежным, быстрый способ идентификации большинства клинически значимых бактерий при нанесении на колоний на твердых средах. Применение MALDI-TOF MS непосредственно к культуре крови бульона является привлекательным подход, поскольку он имеет потенциал для ускорения идентификации видов бактерий и улучшить клиническое управление. Тем не менее, важной проблемой для преодоления является удаление предварительно анализ интерферирующих смол, белков и гемоглобина, содержащихся в культуре образцов крови, которые, если их не удалить, мешают MS спектров и может привести к недостаточному или низкими оценками идентификации дискриминации. Кроме того, необходимо сосредоточиться BacterИ.А. развивать спектры достаточно высокого качества. Представленный метод описывает концентрацию, очищение, и извлечение грамотрицательных бактерий, позволяющих раннего выявления бактерий из сигнальном культуры крови бульоне.
Introduction
Пациенты с инфекции кровотока (BSI) из-за бактерий по-прежнему имеют высокую смертность в стационаре, начиная от 6-48% 1. Доставка соответствующего эмпирического антибиотика способствует выживанию и в подгруппе пациентов с тяжелым сепсисом, каждый час задержки в соответствующей терапии коррелирует со снижением выживаемости 2,3. Соответственно, одной из ключевых задач клинической лаборатории является быстрое обнаружения, идентификации и общайтесь присутствие бактерий в культурах крови сообщить клинические решения. Было показано, что микробиологическая лаборатория имеет наибольшее влияние на антимикробной терапии на момент отчетности Граму 4 и недавно, обсервационное исследование показало, что время матрица-активированная лазерная десорбция / ионизация массового полета спектрометрии (MALDI-TOF MS) выполняется непосредственно на культуры крови бульонов влиять назначения в более чем одной трети BSI, вызванного грамотрицательных бактерий 5.
<p class="Jove_content"> Промышленное освоение MALDI-TOF MS привело к действенным лабораторного инструмента для идентификации микроорганизмов 6,7. Технология в настоящее время хорошо известны и была интегрирована в многих лабораториях для быстрого и точного определения микроорганизмов, выделенных на твердой среде 6,8. Прямое применение MALDI-TOF MS культуры крови (до н.э.) бульона, что дали понять, "позитивный" для микроорганизмов обращений в обоих клиницистов и лабораторного менеджеров из-за возможности получения более раннюю идентификацию микроорганизмов при низких затратах.Клиническая полезность прямого применения MALDI-TOF MS к культуре крови бульона было ограничено широким диапазоном чувствительности наблюдаемых по сравнению со стандартным фенотипическая культуры на основе методов идентификации, с сообщениями о успешной идентификации грамотрицательных бактерий, начиная от 47-98.9 % 9-11. Изменение чувствительности всегоотносится к композиции бульона BC, начальной концентрации бактерий, вариации методов подготовки образцов, а также массив грамотрицательных организмов, встречающихся в популяции исследования 9. По сравнению с этими другими опубликованными протоколами метод, представленный здесь избегает использования этанола, хлорид аммония или дополнительного (не матрица) ацетонитрила. В результате бактериальный осадок не будет остаются жизнеспособными (до точки экстракции белка), позволяющий потенциальные методы испытаний фенотипический восприимчивость к быть нанесен непосредственно на этих организмов в бульоне. Кроме того, данный способ, как было показано, чтобы быть недорогой, надежный и быстрый с бактериальной идентификации доступных в пределах 25 мин из культуры крови грамотрицательных результатов окраски, с минимальными "руки на" время 12.
Этот метод представляет собой простой протокол в доме спин-лизис использования добычу муравьиной кислоты наносится непосредственно на положительных культуральных бульонах крови для выявления грамотрицательных бacteria с технологией MALDI-TOF MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важно при применении MALDI-TOF MS в культуральной жидкости крови, что шаги сообщение центрифугирования выполняются с достаточной осторожностью, чтобы не ремикс разделенных компонентов. Особенно важно, чтобы удалить культуры крови составляющие и клеточных белков человека, включая гемогло?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod’hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
