Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör
Summary
Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.
Abstract
Trypanosoma brucei sığır 1, insan Afrika trypanosomiasis (HAT), ya da uyku hastalığı ve israf hastalığı, nagana neden olan bir kinetoplastida parazittir. Memeli konakçının kan ve çeçe sineği vektörü arasındaki parazit seçim yapar. Pek çok hücresel organellerin bileşimi bu farklı hücre dışı koşullara 2-5 cevaben değişir.
Glycosomes glikoliz katılan enzimlerin çoğu bölmeli olan yüksek seviyede uzmanlaşmış peroksizomlar bulunmaktadır. Gelişimsel ve çevresel düzenlenmiş şekilde 4-11 Glycosome kompozisyon değişir. Şu anda, glycosome dinamiklerini incelemek için kullanılan en yaygın teknikler elektron ve floresan mikroskopisi; pahalı, zaman ve emek yoğun ve yüksek verimlilik analizleri kolayca adapte değildir teknikleri.
Bu sınırlamaları, bir flüoresan raportör sistemi-glycosome üstesinden gelebilmek için,12 glycosomes için, füzyon proteini yönlendiren peroksizom hedefleme dizisi (PTS2) kaynaşır sarı floresan protein (EYFP) geliştirilmiş olan kurulmuştur. PTS2eYFP füzyon proteininin ithalinde, glycosomes floresan olur. Organel bozulması ve akış sitometrisi ile ölçülebilir floresans kaybı geri dönüşüm ile sonuçlanır. Hücrelerin büyük sayılar (5,000 hücre / sn) gibi tespit ve montaj gibi geniş numune hazırlama olmadan gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir. Bu yöntem, çevre koşulları dalgalı yanıt olarak bir organel kompozisyonunda değişikliklere tespit hızlı bir yol sunar.
Introduction
Trypanosoma brucei sığır Afrika insanlarda uyku hastalığından ve israf hastalığı, nagana neden olur. Bu hastalıkların tedavisinde kullanılan ilaçlar, aşılar mevcut değildir, eskimiş ve son derece zehirlidir ve ilaç direnci gelişimi için potansiyel yeni ilaç hedefleri 1 için arama gerektirir.
Ömrünün, T. sırasında brucei, bir böcek vektör ve memeli ev sahibi arasında dönüşümlü; parazit hayatta gerekir hangi çok farklı ortamlarda sergileyen iki ana. Parazit farklı çevre koşullarına maruz gibi metabolik ve morfolojik değişikliklerin bir dizi ortaya çıkar. En dramatik değişikliklerden bazıları tek-zar-sınırlı parazit özgü Mikrocisimler gözlenir, glycosomes 13 adlandırılır.
Glukoz seviyeleri nispeten yüksek (~ 5 mM) kan ve kan parazitler (BSF) glikolisis wh ile sadece ATP üretmekIle mitokondriyal metabolizma 14 bastırılır. Ökaryotlarda farklı olarak, glikoliz, sitoplazma, T. oluşur brucei glycosomes 14,15 glikolitik enzimlerin çoğu compartmentalizes. Parazitler, bir bloodmeal sırasında çeçe sineği tarafından alınır ve sinek tarafından sindirildikten 15 dakika içinde tespit edilemez seviyelere düşer glikozunda bir düşmenin, yaşarlar. Böcek metabolizması, procyclic formu (PCF), parazit daha esnek ve glukoz gibi, prolin gibi amino asitler, ATP, 16-18 sentezinde kullanılabilir olduğunu. Karşılaştırmalı proteomik çalışmalar yaşam döngüsü glycosomal bağımlı değişiklikler ve kan parazitlerin artan glikolitik proteinler ile mitokondriyal proteinler ve TCA döngüsü ve solunum zincirinde 13,19 katılan mitokondriyal proteinleri ortaya. Birçok çalışma BSF ve PCF glycosomes arasındaki farklar odaklanmış olsa da, küçük env tepki olarak ortaya PCF glycosomes değişiklikler hakkında bilinmektedirironmental değişir.
Sineğin hindgut, glukoz düzeyleri bir beslenme 20 sırasında geçici artışlar ile düşüktür. In vitro çalışmalar çoğunda, PCF parazitler glikoz içeren ortamda yetiştirilmektedir. Ancak son çalışmalar önemli ölçüde yanıt PCF metabolizma değişiklikleri durumunu 17 glikoza olduğunu göstermiştir. Glukoz, prolin alım ve prolin dehidrojenaz aktivitesi artışı 18 yokluğunda. Mitokondrial metabolizmanın bu değişiklik muhtemelen glycosome kompozisyon ve morfolojisinde bir değişime de eşlik eder, bununla birlikte, bu direkt olarak değerlendirilmemiştir.
Elektron ve floresan mikroskobu yaygın teknikler T. glycosome dinamiklerini incelemek için kullanılır brucei 2,21-24. Bu protokoller, zaman ve yoğun, pahalı ve gerçek zamanlı çalışma ve yüksek verimli protokollere adapte zor doğum. Bir floresan-organel muhabiri sistemi u bu sınırlamayı aşmak içinmemeli hücreleri ve maya sistemlerinin organellere çalışma sed T. kullanılmak üzere modifiye edilmiştir brucei 12.
Floresan-organel haberci sistemleri yaygın gibi maya, bitki ve memeli hücreleri de 25-27 gibi daha yüksek ökaryotlardaki kullanılmıştır. Bu gibi sistemlerde, bir flüoresan proteini spesifik organellere proteini hedefler bir amino asit sekansına kaynaştırılır. Hedef proteinlerin bozulması veya sentez floresan ölçülmektedir ve organel bileşim değişiklikler hücre flüoresanlıktaki değişikliklerle yansıtılmaktadır.
Geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) 'nin açık okuma çerçevesi, bir tip II peroksisomal hedefleme sekansı (PTS2) ve 12 bağlı olduğunda, olgun bir protein PTS2eYFP, ithal yetkin glycosomes ve floresan içine alınır, akış sitometrisi vasıtasıyla izlenebilir. Glycosome bileşim içinde varyasyonlar hücresel flüoresanlıktaki değişikliklerle yansıtılmaktadır. Bu sistem, resol yardımcı olabilirglycosome bileşim içinde çevreden kaynaklanan değişiklikler belirleyen mekanizmaları VING.
Bu yazıda canlı parazitlere gerçek zamanlı glycosome dinamiklerini izlemek için akış sitometrisi ile bağlantılı PCF parazitler bir glycosome raportör sistemin üretimini tarif ve farklı ortamlarda yanıt olarak glycosome bileşim değişimlerin izlenmesi için kullanılmıştır bir örnek sağlamaktadır. Taze ortam glycosome kompozisyonunda değişikliklere tetikler içine Özet olarak, bileşim, glycosome hücre dışı glükoz konsantrasyonu ve log-faz geçişi kültürlerin etkilenir. Bu sistem tripanozomlarına ve diğer parazitlerin diğer organellerin dinamik davranışlarını incelemek için modifiye edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycosomes temel, dinamik, parazit özgü organellerdir. Bu organellerin biyogenezi, bakım, çoğalması ve biçimlenme düzenleyen süreçler olası terapötik amaçlar için istismar edilebilir ilaç hedefleri arasındadır. Bu tür ilaç hedefleri potansiyel olarak yüksek bolluğuna rağmen, daha glycosome biyogenez alan baskın nedeniyle, hızlı ve dinamik organel karşılıklarının izlenmesi için olan bir izlenebilir, yüksek hacimli sistem eksikliği, bir başka organizmalarda benzer süreçlerle ilgili çal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.
Materials
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium Chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50X) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100X) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium Biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A.Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
References
- Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
- Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
- Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
- Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
- Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
- Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
- Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
- Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae – new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
- Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
- Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
- Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
- Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
- Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
- Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
- Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
- Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
- Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
- Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
- Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
- Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
- Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
- Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
- Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi’s glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
- Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
- Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
