שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי
Summary
Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.
Abstract
Trypanosoma brucei הוא טפיל kinetoplastid שגורם trypanosomiasis אדם אפריקאי (HAT), או מחלת שינה, ומחלה ממארת, nagana, בבקר 1. חלופות הטפיל בין זרם הדם של המארח של היונקים ווקטור זבוב tsetse. הרכב רב אברונים תאיים משתנה בתגובה לתנאים תאיים השונים אלה 2-5.
Glycosomes הוא peroxisomes מאוד מיוחד שבו רב של האנזימים המעורבים בגליקוליזה הם ממודרים. Glycosome שינויי הרכב באופן התפתחותי ומוסדר לסביבה 4-11. נכון לעכשיו, את הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש ללמוד glycosome דינמיקה הן מיקרוסקופ אלקטרונים וקרינה; טכניקות שאינן יקר, זמן והעבודה אינטנסיבית, ולא בקלות הסתגל לתפוקה גבוהה מנתח.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, מערכת כתב ניאון-glycosome בשהגדל חלבון צהוב ניאון (EYFP) הוא התמזגה לרצף peroxisome מיקוד (PTS2), המכוון את חלבון ההיתוך לglycosomes 12, כבר נקבע. על היבוא של חלבון היתוך PTS2eYFP, glycosomes הפך ניאון. השפלה אברון ותוצאות מחזור בהפסד של הקרינה שניתן למדוד על ידי cytometry זרימה. מספר גדול של תאים (5,000 תאים / sec) ניתן לנתח בזמן אמת ללא הכנת מדגם נרחבת כגון קיבעון והרכבה. שיטה זו מציעה דרך מהירה לזיהוי שינויים בהרכב אברון בתגובה לתנודות בתנאים סביבתיים.
Introduction
Trypanosoma brucei גורם מחלה אפריקה שינה בבני אדם ומחלה ממארת, nagana, בבקר. תרופות המשמשות לטיפול במחלות אלה הן מיושנות ורעילים ביותר, חיסונים אינם זמינים, ואת הפוטנציאל לפיתוח עמידות לתרופה מחייב חיפוש אחר מטרות תרופה חדשות 1.
במהלך מחזור החיים שלה, ט brucei, מתחלף בין וקטור חרקים ומארח של יונקים; שני צבאות המציגים סביבות שונות מאוד שבו הטפיל חייב לשרוד. מספר השינויים מטבוליים ומורפולוגיים להתרחש כטפיל חשוף לתנאים סביבתיים שונים. חלק מהשינויים הדרמטיים ביותר שנצפו בmicrobodies הספציפי טפיל חד-מתוחם קרום, מכונה glycosomes 13.
רמות הגלוקוז גבוהות יחסית (~ 5 מ"מ) בזרם הדם וטפילי דם (BSF) לייצר ATP באופן בלעדי דרך ש"ש גליקוליזהחילוף חומרים במיטוכונדריה ile מודחק 14. בניגוד לאאוקריוטים אחרים בי הגליקוליזה מתרחשת בציטופלסמה, ט brucei ממדר את רוב אנזימי glycolytic בglycosomes 14,15. הטפילים נתפסים על ידי זבוב tsetse במהלך bloodmeal וחווים ירידה ברמת סוכר, שנופלת לרמות בלתי ניתנות לגילוי בתוך 15 דקות מנטילה על ידי הזבוב. חילוף החומרים של חרק, צורת procyclic (PCF), טפילים הוא גמישה יותר וגלוקוז, וכן חומצות אמינו כגון פרולין, ניתן להשתמש בסינתזה של ATP 16-18. מחקרי proteomic השוואתיים לגלות שינויי מחזור חיים תלויים בglycosomal וחלבוני המיטוכונדריה עם חלבוני glycolytic גדלו בטפילי דם וחלבוני המיטוכונדריה מעורבים במחזור TCA ושרשרת הנשימה 13,19. בעוד שמחקרים רבים התמקדו בהבדלים בין BSF וglycosomes PCF, מעט מאוד ידוע על השינויים בglycosomes PCF המתרחשים בתגובה לenvשינויי ironmental.
במעי האחורי של הזבוב, רמות הגלוקוז נמוכות עם עליות חולפות במהלך האכלה 20. ברוב בניסויים במבחנה, טפילי PCF גדלים בתקשורת המכילה גלוקוז. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי שינויי חילוף חומרים PCF באופן משמעותי בתגובה לגלוקוז זמינות 17. בהעדר של גלוקוז, ספיגת פרולין וגידול פעילות dehydrogenase פרולין 18. שינוי בחילוף החומרים במיטוכונדריה זה סביר מלווה בשינוי בהרכב glycosome ומורפולוגיה, עם זאת, זה לא העריך באופן ישיר.
אלקטרונים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הם טכניקות נפוצות בשימוש ללמוד דינמיקת glycosome בט brucei 2,21-24. פרוטוקולים אלה הם זמן ועבודה אינטנסיבית, יקרה, וקשה להסתגל ללימודים בזמן אמת ופרוטוקולי תפוקה גבוהה. כדי להתגבר על מגבלה זו, מערכת כתב ניאון-אברון uSED ללמוד האברונים במערכות יונקים ושמרים כבר שונה לשימוש בט brucei 12.
מערכות כתב הניאון-אברון נעשו שימוש נרחב באאוקריוטים גבוהים יותר כמו שמרים, צמח, ותאי יונקים 25-27. במערכות כאלה, חלבון פלואורסצנטי הוא התמזגו לרצף חומצות אמינו שמכוון את החלבון לאברונים ספציפיים. השפלה או הסינתזה של החלבונים הממוקדים נמדדה באמצעות הקרינה ושינויים בהרכב אברון באים לידי ביטוי בשינויים בקרינה סלולארי.
כאשר מסגרת הקריאה הפתוחה של חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) הוא התמזגה לרצף מיקוד peroxisomal הסוג II (PTS2) 12, חלבון PTS2eYFP מיובא לglycosomes בוגר, יבוא ומוסמך וקרינה יכולה להיות במעקב באמצעות cytometry זרימה. וריאציות בglycosome הרכב באות לידי ביטוי בשינויים בקרינה סלולרית. מערכת זו יכולה לסייע בResolוינג המנגנונים המווסתים את השינויים הנגרמים לסביבה בglycosome הרכב.
כתב יד זה מתאר את הדור של מערכת כתב glycosome בטפילי PCF בשיתוף עם cytometry הזרימה לעקוב אחר דינמיקת glycosome בזמן אמת בטפילים בשידור חיים ומספק דוגמא לאופן שנעשה בו שימוש כדי לעקוב אחר שינויים בglycosome הרכב בתגובה לסביבות שונות. לסיכום, glycosome הרכב מושפע מריכוזי גלוקוז תאיים והמעבר של תרבויות log-שלב לתקשורת טרי מעוררת שינויים בglycosome הרכב. מערכת זו יכולה להיות שונה כדי ללמוד את ההתנהגות הדינמית של אברונים אחרים בtrypanosomes וטפילים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glycosomes הם אברונים חיוניים, דינמיים, טפיל ספציפי. התהליכים המסדירים את קיום חיים, תחזוקה, השגשוג והשיפוץ של אברונים אלה צפויים לכלול יעדי תרופה שניתן לנצל למטרות טיפוליות. למרות פוטנציאל גבוה השפע של מטרות תרופה כזו, תחום glycosome biogenesis מפגר אחרי המחקר של תהליכים דומים באו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.
Materials
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium Chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50X) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100X) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium Biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A.Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
References
- Stuart, K., et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).
- Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei. Autophagy. 4, 294-308 (2008).
- Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses. Autophagy. 2, 107-118 (2006).
- Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids. Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).
- Michels, P. A., et al. Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review). Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).
- Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target. FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).
- Parsons, M. Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).
- Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae – new data and views. Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).
- Michels, P. A., Hannaert, V. The evolution of kinetoplastid glycosomes. J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).
- Hannaert, V., Michels, P. A. Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida. J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).
- Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome. Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).
- Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei. Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).
- Opperdoes, F. R. Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes. Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).
- Kessler, P. S., Parsons, M. Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase. The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).
- Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources. Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).
- Coustou, V., et al. Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei. The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).
- Lamour, N., et al. Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose. The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).
- Vertommen, D., et al. Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei. Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).
- Vickerman, K. Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes. British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).
- Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p. The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).
- Saveria, T., et al. Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes. Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).
- Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number. Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).
- Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. Identification and validation of Trypanosoma cruzi’s glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal. Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).
- Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules. The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).
- Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER. The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).
- Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation. Cell. 122, 85-95 (2005).
- Furuya, T., et al. Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).
