Mit fluoreszierenden Proteinen zu Glycosome Dynamics in der afrikanischen Trypanosomen auf Monitor
Summary
Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.
Abstract
Trypanosoma brucei ist ein Parasit, der Kinetoplastiden afrikanische Trypanosomiasis (HAT) oder Schlafkrankheit, und eine Wasting Disease, nagana verursacht, bei Rindern 1. Der Parasit wechselt zwischen den Blutstrom des Säugerwirt und die Tsetse-Fliege Vektor. Die Zusammensetzung vieler zellulärer Organellen sich in Reaktion auf diese verschiedenen extrazellulären Bedingungen 2-5.
Glykosomen sind hochspezialisierte Peroxisomen in denen viele der Enzyme der Glykolyse beteiligt Abteile sind. Glycosome Zusammensetzung Änderungen in einer Entwicklungs-und umwelt geregelt 4-11. Gegenwärtig sind die am häufigsten verwendeten Techniken zum glycosome Dynamikstudie Elektronen und Fluoreszenzmikroskopie; Techniken, die teuer, zeit und arbeitsaufwendig und nicht leicht angepasst, um mit hohem Durchsatz untersucht werden.
Um diese Einschränkungen zu, ein fluoreszierendes Reportersystem-glycosome in überwindendie gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) verstärkt wird, um eine Peroxisomen-Zielsequenz (PTS2), die das Fusionsprotein an Glykosomen 12 leitet fusioniert, wurde hergestellt. Beim Importieren der PTS2eYFP Fusionsprotein, Glykosomen geworden fluoreszierend. Organell Abbau und Recycling zu einem Verlust der Fluoreszenz, die durch Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Eine große Zahl von Zellen (5000 Zellen / sec) in Echtzeit ohne umfangreiche Probenpräparation, wie die Fixierung und Befestigung analysiert werden. Dieses Verfahren bietet einen schnellen Weg, Veränderungen in Organellen Zusammensetzung in Abhängigkeit von schwankenden Umgebungsbedingungen.
Introduction
Trypanosoma brucei führt die afrikanische Schlafkrankheit bei Menschen und ein Wasting Disease, nagana, bei Rindern. Medikamente in der Behandlung dieser Krankheiten verwendet werden, sind veraltet und extrem giftig, Impfstoffe nicht verfügbar sind, und das Potenzial für die Entwicklung von Resistenzen die Suche nach neuer Zielmoleküle 1 erfordert.
Während seines gesamten Lebenszyklus, T. brucei, wechselt zwischen einem Insektenvektor und Säugerwirt; zwei Hosts, die sehr unterschiedlichen Umgebungen, in denen der Parasit muss überleben zu präsentieren. Eine Anzahl von metabolischen und morphologischen Veränderungen auftreten, wie der Parasit an verschiedene Umweltbedingungen ausgesetzt. Einige der dramatischsten Veränderungen sind in Single-Membran-Parasiten begrenzt spezifischen Mikrokörper beobachtet, genannt Glykosomen 13.
Zuckerspiegel relativ hoch sind (~ 5 mm) in den Blutkreislauf und Blutkreislauf Parasiten (BSF) erzeugen ATP ausschließlich über Glykolyse while mitochondrialen Stoffwechsels unterdrückt wird 14. Im Gegensatz zu anderen Eukaryoten, in der Glykolyse im Zytoplasma, T. auftritt brucei compartmentalizes meisten der glykolytischen Enzyme in Glykosomen 14,15. Die Parasiten werden von der Tsetse-Fliege während einer Blutmahlzeit aufgenommen und erleben Sie einen Tropfen in Glukose, die die Nachweisgrenze innerhalb von 15 Minuten, von der Fliege aufgenommen fällt. Der Metabolismus von Insekten ist procyclischen Form (PCF) Parasiten flexibler und Glucose, sowie Aminosäuren, wie Prolin, kann bei der Synthese von ATP 16-18 verwendet werden. Vergleichsproteomische Studien zeigen, Lebenszyklus abhängigen Veränderungen glycosomalen und mitochondrialer Proteine mit glykolytischen Proteine in Blutkreislauf erhöht und Parasiten mitochondrialen Proteine im TCA-Zyklus und Atmungskette 13,19 beteiligt. Viele Studien haben sich auf die Unterschiede zwischen BSF und PCF Glykosomen konzentriert, ist wenig über die Veränderungen in PCF Glykosomen, die in Antwort auf env kommen bekannteironmental Veränderungen.
Im Enddarm der Fliege, Zuckerwerte sind während einer Fütterung mit 20 niedrig vorübergehenden Anstieg. In den meisten in-vitro-Studien werden PCF Parasiten in Medien Glukose gezüchtet. Allerdings haben jüngste Studien gezeigt, dass PCF Stoffwechsel verändert sich signifikant in Reaktion auf Verfügbarkeit 17 Glucose. In Abwesenheit von Glucose, Prolin und Prolin-Aufnahme-Dehydrogenase-Aktivität um 18. Diese Änderung in der mitochondrialen Stoffwechsel wird wahrscheinlich durch eine Änderung der Zusammensetzung und Morphologie glycosome begleitet, hat sich dies jedoch nicht direkt beurteilt.
Elektron und Fluoreszenzmikroskopie sind gängige Techniken verwendet werden, um glycosome Dynamik in T. studieren brucei 2,21-24. Diese Protokolle sind Zeit und arbeitsintensiv, teuer und schwierig, um Echtzeit-Studien und Hochdurchsatz-Protokolle anzupassen. Um diese Einschränkung zu überwinden, eine Leuchtstoff-Organellen-Reportersystem uSED Organellen in Säugern und Hefen Systemen Studie zur Verwendung in T. modifiziert worden ist brucei 12.
Fluoreszierenden Organellen Reportersysteme sind ausführlich in höheren Eukaryoten, wie Hefe, Pflanzen und Säugerzellen 25-27 verwendet. In solchen Systemen wird ein fluoreszierendes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die das Protein zu spezifischen Organellen richtet fusioniert. Der Abbau oder die Synthese der Zielproteine wird durch Fluoreszenz gemessen und Veränderungen in der Organelle Zusammensetzung werden durch Änderungen in der Fluoreszenzzelle reflektiert.
Wenn der offene Leserahmen von verbesserten gelb fluoreszierende Protein (eYFP) zu einer Typ-II-peroxisomale Targeting-Sequenz (PTS2) 12 verschmolzen ist, wird die PTS2eYFP Protein zu reifen, Import-und Fluoreszenz zuständigen Glykosomen importiert über Durchflusszytometrie überwacht werden. Variationen in glycosome Zusammensetzung werden durch Veränderungen der zellulären Fluoreszenz wider. Dieses System kann in Resol helfenVing die Mechanismen, die umweltbedingte Veränderungen in glycosome Zusammensetzung regulieren.
Diese Handschrift beschreibt die Erzeugung eines glycosome Reportersystem in PCF Parasiten in Verbindung mit Durchflusszytometrie, um Echtzeit glycosome Dynamik in lebenden Parasiten zu überwachen und stellt ein Beispiel, wie es verwendet wurde, um Änderungen in glycosome Zusammensetzung in Abhängigkeit von verschiedenen Umgebungen zu folgen. Zusammenfassend wird glycosome Zusammensetzung durch extrazelluläre Glukosekonzentrationen und der Durchgang von Log-Phase Kulturen beeinflusst in frischem Medium löst Veränderungen im glycosome Zusammensetzung. Das System kann modifiziert werden, um das dynamische Verhalten des anderen Organellen in Trypanosomen und andere Parasiten untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glykosomen sind unerlässlich, dynamisch, Parasiten-spezifische Organellen. Die Prozesse, die die Biogenese, Wartung, Proliferation und Umbau dieser Organellen regulieren wahrscheinlich auch Wirkstoff-Targets, die für therapeutische Zwecke genutzt werden könnten. Trotz der möglichen hohen Fülle solcher Arzneimitteltargets wurde der Bereich der glycosome Biogenese hinter der Studie von ähnlichen Prozessen in anderen Organismen, hauptsächlich aufgrund des Fehlens eines handhabbaren, Hochdurchsatz-System, mit dem ein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.
Materials
| Adenosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A10781 | SDM79 Ingredient |
| L-Alanine | Avocado Research Chemicals Ltd | A15804 | SDM79 Ingredient |
| L-arginine | CalBiochem | 1820 | SDM79 Ingredient |
| p-aminobenzoic acid | ICN Biomedicals | 102569 | SDM79 Ingredient |
| Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X) | Sigma | B6891 | SDM79 Ingredient |
| Biotin | Fisher | BP232-1 | SDM79 Ingredient |
| Calcium Chloride | VWR | BDH0224 | Cytomix |
| EDTA | Fisher | S311-100 | Cytomix ingredient |
| EZNA Gel Extraction kit | Omega Biotek | D2500-01 | DNA purifiation |
| Research grade Serum | Fisher | 03-600-511 | SDM79 Ingredient |
| Folic acid | ICN Biomedicals | 101725 | SDM79 Ingredient |
| Glucosamine HCl | ICN Biomedicals | 194671 | SDM79 Ingredient |
| Glucose | GIBCO | 15023-021 | SDM79 Ingredient |
| L-glutamine | CalBiochem | 3520 | SDM79 Ingredient |
| Glycerol | Acros Organics | Ac15892-0010 | Freezing media |
| Graces insect cell media powder | GIBCO | 11300-043 | SDM79 Ingredient |
| Hemin | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Guanosine | Avocado Research Chemicals Ltd | A11328 | SDM79 Ingredient |
| HEPES | MP Biomedicals | 194025 | SDM79 Ingredient |
| Magnesium Chloride | Fisher | BP214-500 | Cytomix ingredient |
| L-methionine | Fisher | BP388-100 | SDM79 Ingredient |
| MEM Amino Acids (50X) | Cellgro | 25-030-CI | SDM79 Ingredient |
| NEAA Mixture (100X) | Lonza | 13-114E | SDM79 Ingredient |
| Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine | Cellgro | 10-010-CM | SDM79 Ingredient |
| MOPS | Fisher | BP308-500 | SDM79 Ingredient |
| Sodium Biocarbonate | Fisher | S233-500 | SDM79 Ingredient |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Cellgro | 30-002-CI | SDM79 Ingredient |
| L-phenylalanine | ICN Biomedicals | 102623 | SDM79 Ingredient |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Cytomix ingredient |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisheer | P290-212 | Cytomix ingredient |
| L-proline | Fisher | BP392-100 | SDM79 Ingredient |
| L-serine | Acros Organics | 56-45-1 | SDM79 Ingredient |
| Pyruvic acid, sodium salt | Acros Organics | 113-24-6 | SDM79 Ingredient |
| L-taurine | TCI America | A0295 | SDM79 Ingredient |
| L-threonine | Acros Organics | 72-19-5 | SDM79 Ingredient |
| L-tyrosine | ICN Biomedicals | 103183 | SDM79 Ingredient |
| E.Z.N.A.Cycle Pure kit | Omega Biotek | D6492-02 | DNA purification |
| Binding buffer | Omega Biotek | PDR041 | DNA purification |
| SPW wash buffer | Omega Biotek | PDR045 | DNA purification |
| Gene Pulser Xcell | Biorad | 165-2660 | Trypanosome transformation |
| 4 mm electroporation cuvettes | VWR | Trypanosome transformation |
References
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