Разработка IFN-γ ELISPOT Пробирной для оценки вирусом ветряной оспы конкретных клеточный иммунитет Вслед пуповинной крови трансплантации
Summary
Новые поколения функциональных анализов, таких как гамма-интерферона (IFN-γ) ELISpot, которые обнаруживают продукцию цитокинов на уровне одной клетки и обеспечить как количественную и качественную характеристику Т-клеточные ответы могут быть использованы для оценки клеточно-опосредованные иммунные реакции, направленные против ветряной оспы вирус (VZV).
Abstract
Вирус ветряной оспы (ВВО) является одной из основных причин заболеваемости и смертности следующей пупочной трансплантации пуповинной крови (UCBT). По этой причине, противогерпетической профилактика администрируется систематически педиатрических получателей UCBT для предотвращения осложнений, связанных с VZV инфекции, но нет сильного и основанных на доказательствах мнение, что определяет его оптимальную продолжительность. Поскольку T клеточный иммунитет отвечает за контроль VZV-инфекции, оценка VZV воссоздание конкретных ответов Т-клеток следующее UCBT может обеспечить индикацию относительно того, профилактика должна быть сохранена или может быть прекращено. С этой целью VZV специфический гамма-интерферон (IFN-γ) фермент-связанный ImmunoSpot (ELISpot) был разработан анализ для характеристики производства IFN-γ Т-лимфоцитами в ответ на стимуляцию в пробирке с облучаемой живой аттенуированной вакцины VZV. Этот препарат обеспечивает быстрое, воспроизводимое и чувствительное измерение VZV конкретного слокоть иммунитет подходящий для мониторинга воссоздание VZV специфического иммунитета в клинических условиях и оценки иммунологическую реактивность к ВВЗ антигенов.
Introduction
Сначала выполненный в 1989 году, UCBT все шире используется как часть лечении различных опухолевых и неопухолевых заболеваний крови у детей 1. ВВО является цитопатический человеком alphaherpesvirus который вызывает два различных заболеваний, ветряной оспой (после первичного инфицирования) и опоясывающий лишай (после реактивации). После первичной инфекции, ВВО сохраняется в течение всей жизни хозяина защищенном пределах чувствительных нервов ганглиях задних корешков. Одним из наиболее опасных инфекционных осложнений после UCBT связан с VZV 2-4. В нашем клиническом центре, в отсутствии VZV профилактики, кумулятивное падение заболевания VZV болезни VZV на 3 года postUCBT составила 46% 2. У этих больных, заново инфекция или реактивация ВВЗ часто ассоциируется с висцеральной распространения в центральной нервной системе, легких и печени 5-7. В результате, ацикловир, валацикловир или фамцикловир профилактика обычно управляются с UBПолучатели CT 8,9. Однако, эта стратегия лечение не принимать во внимание защитный потенциал VZV специфических Т-лимфоциты или кинетики воссоздания VZV конкретных ответов Т-клеток. Потенциальные проблемы, связанные с расширением использования долгосрочных противогерпетических профилактики включают) избыточного лечения пациентов; б) развитие устойчивость к противовирусным препаратам 10,11; и в) нарушение VZV специфического иммунного восстановления 12,13. Поскольку обнаружение функциональных VZV специфических Т-лимфоцитов коррелирует с наличием долгосрочного защиты от VZV-инфекции и улучшению клинического исхода 4,14,15, мониторинг клеточно-опосредованный иммунный ответ, направленные против VZV в течение периода после трансплантации может привести к более рациональному использованию противовирусных лечение, позволяя практикующих врачей, чтобы отличить пациентов, которые больше всего выигрывают от ВВЗ профилактика от тех, чья иммунная система способна контролировать VZV репликации 4,13.
ИФН-γ ELISpot анализ широко используется для мониторинга клеточных опосредованных иммунных реакций в различных экспериментальных систем и клинических условиях. Пятна образуются после расщепления хромогенного субстрата, создавая видимый осадок и стабильной в месте реакции. Каждый человек место, таким образом, представляет собой след отдельного цитокинов производящих клетки. IFN-γ ELISpot не только измеряет способность отдельных клеток экс виво для получения IFN-γ в ответ на стимуляцию в пробирке с антигеном, но она также обеспечивает оценку частоты реагирует клетки в данной популяции клеток 16,17. В дополнение к своей высокой чувствительности, IFN-γ ELISpot проста для выполнения, что делает возможным его использование в контексте персональной клинических протоколов, направленных на руководящих инициирование или прекращение противовирусного лечения. Процедура подробно описаны ниже описания тогоэс анализ ELISpot, которая специально предназначена для обнаружения и измерения производство IFN-γ на мононуклеарных клеток периферической крови после стимуляции в пробирке с ВВО, полученных антигенов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изменения и устранение неисправностей: ИФН-γ ELISPOT анализы были использованы для изучения клеточно-опосредованные иммунные реакции, направленные против различных патогенных микроорганизмов, в том числе вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) 24,25, вирус гепатита С (HCV) 26, 27</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить участников исследования и их родителей. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Режан Lapointe (CHUM Notre-Dame, Монреаль, Канада) для доступа к его ELISpot читателя, д-р Любо Александрова для статистического анализа, и Денис Blais, Сандра Кэрон, Сильвия Валуа и Мартин Caty для экспертно-техническое помощь. При поддержке грантов от ле Fonds d'операции налить ле PROJETS по исследованиям Clinique др. d'Evalution DES технологий (ЧУ Sainte-Justine) для HS и ПО, по-ла Fondation Centre де cancérologie Charles-Бруно, а к лейкемии и лимфомы общества Канада. МФС была поддержана стипендии от ла Fondation CHU Sainte-Justine и ле Fonds де-ла-Recherche Квебека-Здоровье (FRQS). AJG был удостоен стипендии от кафедры микробиологии, инфектологии и иммунологии, Университета Монреаля (Gabriel-Маркиз стипендий), FRQS, и канадские институты здравоохранения Rсследования (CIHR). Н.М. поддержали ла Fondation CHU Sainte-Justine, Коула Foundation, и FRQS.
Materials
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients – a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation–a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
