פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים
Summary
דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV).
Abstract
נגיף אבעבועות רוח זוסטר (VZV) הוא גורם משמעותי לתחלואה ותמותה לאחר השתלת דם טבורי (UCBT). מסיבה זו, טיפול מונע antiherpetic מנוהל באופן שיטתי לנמעני UCBT ילדים כדי למנוע סיבוכים הקשורים לזיהום VZV, אבל אין הסכמה שמגדירה את משך הזמן האופטימלי שלו חזקה, המבוסס על ראיות. בגלל חסינות תא בתיווך T היא אחראית על הבקרה של זיהום VZV, הערכה מחדש של תגובות תא T הספציפיות VZV הבא UCBT יכול לספק אינדיקציות באשר לשאלה האם יש לשמור טיפול מונע או יכול להיות שהופסק. לשם כך, assay אינטרפרון גמא הספציפי VZV (IFN-γ) Immunospot צמוד אנזים (ELISPOT) פותח כדי לאפיין ייצור IFN-γ על ידי לימפוציטים מסוג T בתגובה לגירוי במבחנה עם חיסון VZV מוקרן חי מוחלש. assay זה מספק מדידה מהירה, לשחזור ורגישה של ג הספציפי VZVell תיווך חסינות מתאימה לניטור הכינון מחדש של חסינות ספציפית VZV בסביבה קלינית והערכת תגובה חיסונית לאנטיגנים VZV.
Introduction
בוצע לראשונה בשנת 1989, UCBT משמש יותר ויותר כחלק מהטיפול בהפרעות דם neoplastic וnonneoplastic שונות בילדים 1. VZV הוא alphaherpesvirus אדם cytopathic אשר גורם לשתי מחלות שונות, אבעבועות רוח (לאחר הדבקה ראשונית) והרפס זוסטר (לאחר הפעלה מחדש). בעקבות זיהום ראשוני, VZV נמשך לאורך כל חייו של המארח המוגן בתוך עצבי תחושה של גרעיני שורש הגבי. אחד הסיבוכים זיהומיות המאיימים ביותר הבאים UCBT קשור VZV 2-4. במרכז הקליני שלנו, בהעדר טיפול מונע VZV, ההיארעות המצטברת של מחלת VZV מחלה VZV לאחר 3 שנות postUCBT הייתה 46% 2. בחולים אלה, דה זיהום נובו עם או הפעלתו מחדש של VZV קשור לעתים קרובות עם הפצה קרביים למערכת העצבים המרכזית, ריאות וכבד 5-7. כטיפול מונע תוצאה מכך, acyclovir, valacyclovir או famciclovir מנוהל בדרך כלל UBמקבלי CT 8,9. עם זאת, אסטרטגיית טיפול זו אינה מביאה בחשבון את הפוטנציאל ההגנתי של לימפוציטים מסוג T או VZV ספציפי קינטיקה של הכינון מחדש של תגובות תא T הספציפיות VZV. בעיות פוטנציאליות הקשורים לשימוש המתרחב של טיפול מונע antiherpetic לטווח ארוך כוללות טיפול יתר) מטופל; ב) ההתפתחות של עמידות לתרופות אנטי 10,11; וג) ירידת ערך הכינון מחדש חיסוניים הספציפי VZV 12,13. בגלל זיהוי של לימפוציטים מסוג T הפונקציונלי VZV הספציפי בקורלציה עם הנוכחות של הגנה לטווח ארוך מפני זיהום VZV ותוצאה קלינית משופר 4,14,15, ניטור תגובות חיסוניים תא בתיווך המכוון נגד VZV במהלך התקופה לאחר ההשתלה עלול לגרום לשימוש מושכל יותר של נגיפים טיפול על ידי המאפשר רופאים כדי להבחין בין חולים שיפיקו תועלת מהטיפול מונע VZV מאלו שמערכת החיסון מסוגל לשלוט שכפול VZV 4,13.
Assay ELISPOT γ-IFN נעשה שימוש נרחב לתגובות החיסונית בתיווך תא ניטור במגוון רחב של מערכות ניסיוניות ומצבים רפואיים. כתמים נוצרים בעקבות המחשוף של מצע chromogenic, שהניבו משקע נראה לעין ויציב באתר של התגובה. כל נקודה בודדת ובכך מייצגת את טביעת הרגל של תא לייצור ציטוקינים בודד. IFN-γ ELISPOT מודד לא רק את היכולת של תאים בודדים vivo לשעבר לייצר IFN-γ בתגובה לגירוי במבחנה עם אנטיגן מאותו המקור, אבל זה גם מספק הערכה של התדירות מגיב תאים באוכלוסיית תא נתון 16,17. בנוסף לרגישות הגבוהה שלו, IFN-γ ELISPOT הוא פשוט לביצוע, מה שהופך את השימוש בו אפשרי בהקשר של פרוטוקולים קליניים אישית שמטרה מנחה ייזום או הפסקה של טיפול אנטי. המפורטים להלן ההליך describes assay ELISPOT כי היא תוכננה במיוחד כדי לזהות ולמדוד את ייצור IFN-γ על ידי תאי הדם היקפיים mononuclear בעקבות גירוי במבחנה עם אנטיגנים VZV נגזרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים ופתרון בעיות: מבחני IFN-γ ELISPOT שימשו כדי לבחון תגובות חיסונית בתיווך תא המכוון נגד מגוון רחב של חיידקים פתוגנים, כוללים סוג וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV-1) 24,25, וירוס הפטיטיס C (HCV) 26, 27, ושחפת Mycobacterium 28,29, רק כדי שם כמה. כאן אנו תיארתי את ההתפתחות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות משתתפי מחקר והוריהם. אנחנו רוצים גם להודות לד"ר Réjean לפוינט (צ'אם נוטרדאם, מונטריאול, קנדה) לגישה לקורא ELISPOT, ד"ר Lubo אלכסנדרוב לניתוח סטטיסטי, ודניס בלה, סנדרה קארון, סילבי ולואה ומרטין Caty למומחה טכני סיוע. נתמך על ידי מענקים ממבצע ד 'le Fonds לשפוך les projets דה המשוכלל ונדירות קליניק et d'évalution des טכנולוגיות (CHU Sainte-Justine) לHS וPO, על ידי la Fondation מרכז דה Cancerologie צ'ארלס-רונו, ועל ידי האגודה לוקמיה & לימפומה של קנדה. ISF נתמכה על ידי מלגות מla Fondation CHU Sainte-ג'סטין וle Fonds דה לה המשוכללת והנדירה du Québec-סנטה (FRQS). AJG היה זוכה במלגות מהמחלקה למיקרוביולוגיה, Infectiology ואימונולוגיה, אוניברסיטת מונטריאול (מלגת גבריאל-מרקיז), FRQS, והמכון הקנדי לבריאות המחקרesearch (CIHR). NM נתמכה על ידי la Fondation CHU Sainte-ג'סטין, קרן קול, וFRQS.
Materials
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients – a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation–a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
