وضع النطاقي الحماقي الفيروسات محددة بوساطة خلية الحصانة ELISPOT الفحص لتقييم الإنترفيرون γ-عقب الحبل السري زرع الدم
Summary
أجيال جديدة من المقايسات وظيفية مثل انترفيرون غاما (الإنترفيرون γ) ELISPOT، الذي كشف عن إنتاج السيتوكينات على مستوى خلية واحدة وتقديم كل من توصيف الكمي والنوعي للاستجابات الخلايا التائية يمكن استخدامها لتقييم الاستجابات بوساطة الخلايا المناعية الموجهة ضد الحماق النطاقي فيروس (جدري الماء).
Abstract
الفيروس النطاقي الحماقي (VZV) هو سبب كبير من المراضة والوفيات التالية السري زرع دم الحبل السري (UCBT). لهذا السبب، يتم إدارتها بشكل منهجي الوقاية antiherpetic إلى المستلمين UCBT الأطفال لمنع المضاعفات المرتبطة عدوى جدري الماء، ولكن ليس هناك والتوافق على أساس أدلة قوية على أن يحدد مدته الأمثل. لأن الخلايا التائية الحصانة بوساطة هي المسؤولة عن السيطرة على العدوى الفيروس النطاقي الحماقي، وتقييم إعادة تشكيل استجابات الخلايا التائية VZV المحددة التالية UCBT يمكن أن توفر مؤشرات حول ما إذا كان ينبغي الحفاظ على الوقاية أو يمكن وقفها. تحقيقا لهذه الغاية، تم تطوير انترفيرون غاما VZV محددة (الإنترفيرون γ) انزيم مرتبط immunospot (ELISPOT) مقايسة لتوصيف إنتاج الإنترفيرون γ بواسطة الخلايا اللمفية تي ردا على التحفيز في المختبر مع المشع الحية الموهنة لقاح جدري الماء. ويوفر هذا الاختبار قياس السريع، واستنساخه وحساسة من VZV ج محددةالذراع بوساطة الحصانة مناسبة لرصد إعادة تشكيل VZV الحصانة محددة في عملية إعداد سريرية وتقييم الاستجابة المناعية لمستضدات الفيروس النطاقي الحماقي.
Introduction
أجريت لأول مرة في عام 1989، ويستخدم UCBT متزايد كجزء من علاج مختلف اضطرابات الدم والأورام لدى الأطفال nonneoplastic 1. جدري الماء هو alphaherpesvirus الإنسان والذي يسبب الاعتلال الخلوي اثنين من أمراض مختلفة، الحماق (بعد العدوى الأولية) والهربس النطاقي (بعد إعادة تنشيط). بعد الإصابة الأولية، VZV استمرت طوال حياة المضيف محمية داخل الأعصاب الحسية من العقد الجذرية الظهرية. واحد من المضاعفات المعدية الأكثر تهديدا التالية UCBT يرتبط مع VZV 2-4. في مركز السريرية لدينا، في غياب VZV الاتقاء، وكان معدل التراكمي للمرض جدري الماء مرض جدري الماء في 3 سنوات postUCBT 46٪ 2. في هؤلاء المرضى، وغالبا ما يترافق مع الإصابة من جديد أو تنشيط VZV مع نشر الحشوية إلى الجهاز العصبي المركزي والرئتين والكبد 5-7. كما يتم إدارتها نتيجة لذلك، الأسيكلوفير، valacyclovir أو famciclovir الوقاية عادة لUBالمتلقين CT 8،9. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية العلاج لا تأخذ بعين الاعتبار إمكانات واقية من الفيروس النطاقي الحماقي الخلايا الليمفاوية T معينة أو حركية إعادة تشكيل استجابات الخلايا التائية VZV محددة. المشاكل المحتملة المرتبطة التوسع في استخدام العلاج الوقائي antiherpetic المدى الطويل وتشمل أ) overtreatment المريض؛ ب) تطوير فيروسات مقاومة للأدوية 10،11؛ وج) ضعف المناعة من الفيروس النطاقي الحماقي إعادة محددة 12،13. لأن الكشف عن الفيروس النطاقي الحماقي وظيفية محددة الخلايا اللمفية تي يرتبط مع وجود حماية على المدى الطويل من عدوى جدري الماء وتحسين النتائج السريرية 4،14،15، ورصد الخلية بوساطة الاستجابات المناعية الموجهة ضد الفيروس النطاقي الحماقي خلال الفترة posttransplant قد يؤدي إلى استخدام أكثر عقلانية من فيروسات العلاج عن طريق تمكين الأطباء الممارسين للتمييز المرضى الذين سيستفيدون من العلاج الوقائي VZV من أولئك الذين قادرة على السيطرة على تكرار VZV 4،13 الجهاز المناعي.
ويستخدم على نطاق واسع ELISPOT مقايسة-γ IFN للخلية الرصد بوساطة الاستجابات المناعية في مجموعة متنوعة من النظم التجريبية والحالات السريرية. يتم إنشاؤها البقع عقب انشقاق من ركيزة مولد اللون، وتوليد راسب وضوحا واستقرارا في موقع رد الفعل. كل بقعة الفردية مما يمثل البصمة خلية المنتجة للخلوى الفردية. الإنترفيرون γ ELISPOT يقيس ليس فقط قدرة الخلايا الفردية فيفو السابقين لإنتاج الإنترفيرون γ ردا على التحفيز في المختبر مع مستضد وما شابه ذلك، ولكنه يوفر أيضا تقديرا من وتيرة الاستجابة الخلايا في السكان خلية معينة 16،17. بالإضافة إلى حساسية عالية، والإنترفيرون γ ELISPOT واضح ومباشر على القيام بها، مما يجعل من الممكن استخدامه في سياق بروتوكولات سريرية شخصية تهدف إلى بدء أو وقف العلاج المضاد للفيروسات التوجيهية. الإجراء المفصلة أدناه describوفاق مقايسة ELISPOT التي تم تصميمها خصيصا لكشف وقياس إنتاج الإنترفيرون γ من قبل خلايا الدم المحيطية التالية في المختبر التحفيز مع مستضدات الفيروس النطاقي الحماقي مشتقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها: قد استخدمت المقايسات الإنترفيرون γ ELISPOT لدراسة الاستجابات بوساطة الخلايا المناعية الموجهة ضد مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض الميكروبية، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (HIV-1) 24،25، فيروس التهاب الكبد الوبائي (سي) <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر المشاركين في الدراسة وأولياء أمورهم. نود أيضا أن نشكر الدكتور Réjean ابونت (CHUM نوتردام، مونتريال، كندا) من أجل الوصول إلى القارئ له ELISPOT الدكتور LUBO الكسندروف للتحليل الإحصائي، ودينيس بليس، ساندرا كارون، سيلفي فالوا ومارتين لكاتي الخبراء التقنيين المساعدة. بدعم من المنح المقدمة من لو فون كوت عملية صب ليه PROJETS للبحوث كلينيك آخرون كوت دي évalution التقنيات (CHU سانت جوستين) إلى HS وPO، التي كتبها la مؤسسة مركز دي cancérologie شارل Bruneau ل، وجمعية سرطان الدم والاورام الليمفاوية من كندا. وأيد قوى الأمن الداخلي من خلال منح دراسية من مؤسسة لا CHU سانت جوستين ولو فون دي لا بحوث كيبيك-صحة (FRQS). كان AJG المستفيدة من المنح الدراسية من قسم علم الأحياء الدقيقة، علم المناعة وInfectiology، جامعة مونتريال (غابرييل ماركيز-منحة)، FRQS، والمعاهد الكندية للصحة Research (CIHR). وأيد NM كتبها la مؤسسة CHU سانت جوستين، ومؤسسة كول، وFRQS.
Materials
| Leucocep tube | VWR | 89048-936/89048-932 | 12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood. |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | Protect from light. |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70746-3 | Keep at -20 C. |
| MultiScreenHTS-IP Filter Plate | Millipore | MSIPS4W10 | Sterile with pore size of 0.45 µm. |
| Mouse anti-human IFN-γ capture antibody | BD Biosciences | 551221 | NIB42 clone. |
| Pepmix VZV IE63 | JPT Peptide Technologies | PM-VZV-IE63 | Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months. |
| Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody | BD Biosciences | 554550 | 4SB3 clone. |
| Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase | Bio-Rad Life Science | 170-3554 | Dilute for use on the same day. |
| BCIP/NBT | Bio-Rad Life Science | 170-6432 | Protect from light. |
References
- Ballen, K. K., et al. Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond. Blood. 122 (4), 491-498 (2013).
- Vandenbosch, K., et al. Varicella-zoster virus disease is more frequent after cord blood than after bone marrow transplantation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (8), 867-871 (2008).
- Barker, J. N., et al. Serious infections after unrelated donor transplantation in 136 children: impact of stem cell source. Biol. Blood Marrow Transplant. 11 (5), 362-370 (2005).
- Merindol, N., et al. Reconstitution of protective immune responses against cytomegalovirus and varicella zoster virus does not require disease development in pediatric recipients of umbilical cord blood transplantation. J. Immunol. 189 (10), 5016-5028 (2012).
- Feldman, S., et al. Varicella in children with cancer: Seventy-seven cases. Pediatrics. 56 (3), 388-397 (1975).
- Arvin, A. M. Varicella-Zoster virus: pathogenesis, immunity, and clinical management in hematopoietic cell transplant recipients. Biol. Blood Marrow Transplant. 6 (3), 219-230 (2000).
- Wiegering, V., et al. Varicella-zoster virus infections in immunocompromised patients – a single centre 6-years analysis. BMC Pediatr. 11, 31 (2011).
- Boeckh, M., et al. Long-term acyclovir for prevention of varicella zoster virus disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation–a randomized double-blind placebo-controlled study. Blood. 107 (5), 1800-1805 (2006).
- Boeckh, M. Prevention of VZV infection in immunosuppressed patients using antiviral agents. Herpes. 13 (3), 60-65 (2006).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: a global perspective. Biol. Blood Marrow Transplant. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Ljungman, P., et al. Long-term acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant. 1 (2), 185-192 (1986).
- Selby, P. J., et al. The prophylactic role of intravenous and long-term oral acyclovir after allogeneic bone marrow transplantation. Br. J. Cancer. 59 (3), 434-438 (1989).
- Distler, E., et al. Recovery of varicella-zoster virus-specific T cell immunity after T cell-depleted allogeneic transplantation requires symptomatic virus reactivation. Biol. Blood Marrow Transplant. 14 (12), 1417-1424 (2008).
- Levin, M. J., et al. Decline in varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity with increasing age and boosting with a high-dose VZV vaccine. J. Infect. Dis. 188 (9), 1336-1344 (2003).
- Jones, L., et al. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur. J. Immunol. 37 (12), 3393-3403 (2007).
- Czerkinsky, C., et al. Reverse ELISPOT assay for clonal analysis of cytokine production. I. Enumeration of gamma-interferon-secreting cells. J. Immunol. Methods. 110 (1), 29-36 (1988).
- Hutchings, P. R., et al. The detection and enumeration of cytokine-secreting cells in mice and man and the clinical application of these assays. J. Immunol. Methods. 120 (1), 1-8 (1989).
- De Castro, N., et al. Varicella-zoster virus-specific cell-mediated immune responses in HIV-infected adults. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 27 (10), 1089-1097 (2011).
- Jones, L., et al. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J. Virol. 80 (19), 9772-9778 (2006).
- Malavige, G. N., et al. Viral load, clinical disease severity and cellular immune responses in primary varicella zoster virus infection in Sri Lanka. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Sadaoka, K., et al. Measurement of varicella-zoster virus (VZV)-specific cell-mediated immunity: comparison between VZV skin test and interferon-gamma enzyme-linked immunospot assay. J. Infect. Dis. 198 (9), 1327-1333 (2008).
- Smith, J. G., et al. Development and validation of a gamma interferon ELISPOT assay for quantitation of cellular immune responses to varicella-zoster virus. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8 (5), 871-879 (2001).
- Ouwendijk, W. J., et al. T-cell immunity to human alphaherpesviruses. Curr. Opin. Virol. 3 (4), 452-460 (2013).
- Rowland-Jones, S. L., et al. Cytotoxic T cell responses to multiple conserved HIV epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi. J. Clin. Invest. 102 (9), 1758-1765 (1998).
- Alter, G., et al. Human immunodeficiency virus (HIV)-specific effector CD8 T cell activity in patients with primary HIV infection. J. Infect. Dis. 185 (6), 755-765 (2002).
- Lechner, F., et al. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J. Exp. Med. 191 (9), 1499-1512 (2000).
- Fournillier, A., et al. A heterologous prime/boost vaccination strategy enhances the immunogenicity of therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J. Infect. Dis. 208 (6), 1008-1019 (2013).
- Adetifa, I. M., et al. Interferon-γ ELISPOT as a biomarker of treatment efficacy in latent tuberculosis infection: a clinical trial. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 187 (4), 439-445 (2013).
- Lalvani, A., Pareek, M. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection. Br. Med. Bull. 93, 69-84 (2010).
- Berger, R., et al. A dose-response study of a live attenuated varicella-zoster virus (Oka strain) vaccine administered to adults 55 years of age and older. J. Infect. Dis. 178 Suppl. 1, (1998).
- Trannoy, E., et al. Vaccination of immunocompetent elderly subjects with a live attenuated Oka strain of varicella zoster virus: a randomized, controlled, dose-response trial. Vaccine. 18 (16), 1700-1706 (2000).
- Brunner, K. T., et al. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Moretta, A., et al. Quantitative assessment of the pool size and subset distribution of cytolytic T lymphocytes within human resting or alloactivated peripheral blood T cell populations. J. Exp. Med. 158 (2), 571-585 (1983).
- Jung, T., et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 159 (1-2), 197-207 (1993).
- Maecker, H. T., et al. Standardization of cytokine flow cytometry assays. BMC Immunol. 6, 13 (2005).
- Nomura, L., et al. Standardization and optimization of multiparameter intracellular cytokine staining. Cytometry A. 73 (11), 984-991 (2008).
- Letsch, A., Scheibenbogen, C. Quantification and characterization of specific T-cells by antigen-specific cytokine production using ELISPOT assay or intracellular cytokine staining. Methods. 31 (2), 143-149 (2003).
- Merindol, N., et al. Umbilical cord blood T cells respond against the Melan-A/MART-1 tumor antigen and exhibit reduced alloreactivity as compared with adult blood-derived T cells. J. Immunol. 185 (2), 856-866 (2010).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Scriba, T. J., et al. Ultrasensitive detection and phenotyping of CD4+ T cells with optimized HLA class II tetramer staining. J. Immunol. 175 (10), 6334-6343 (2005).
- Stone, J. D., et al. Interaction of streptavidin-based peptide-MHC oligomers (tetramers) with cell-surface TCRs. J. Immunol. 187 (12), 6281-6290 (2011).
- Pantaleo, G., et al. Evidence for rapid disappearance of initially expanded HIV-specific CD8+ T cell clones during primary HIV infection. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94 (18), 9848-9853 (1997).
- Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. Immunol. 12 (6), 492-499 (2011).
- Boulet, S., et al. A dual color ELISPOT method for the simultaneous detection of IL-2 and IFN-gamma HIV-specific immune responses. J. Immunol. Methods. 320 (1-2), 18-29 (2007).
- Ahlborg, N., Axelsson, B. Dual- and triple-color fluorospot. Methods Mol. Biol. 792, 77-85 (2012).
- Precopio, M. L., et al. Immunization with vaccinia virus induces polyfunctional and phenotypically distinctive CD8(+) T cell responses. J. Exp. Med. 204 (6), 405-1416 (2007).
- Sadzot-Delvaux, C., et al. Recognition of the latency-associated immediate early protein IE63 of varicella-zoster virus by human memory T lymphocytes. J. Immunol. 159 (6), 2802-2806 (1997).
- Malavige, G. N., et al. IE63-specific T-cell responses associate with control of subclinical varicella zoster virus reactivation in individuals with malignancies. Br. J. Cancer. 102 (4), 727-730 (2010).
