质子转移和蛋白质构象动力学的光敏蛋白的时间分辨步进扫描傅立叶变换红外光谱

样品1。一般问题和仪器准备使用商用的FT-IR光谱仪装备时间分辨步进扫描测量。为获得最佳结果放置的FT-IR光谱仪上的振动解耦表的顶部。 疏散的光学隔室到几毫巴。吹扫样品室与干燥空气或氮气。 放置红外透明材料不透明的FT-IR光谱仪的MCT检测器的前面可见辐射。这种预防措施是必要的，以防止在步进扫描实验，从令人兴奋的激光脉冲文物。注意：我们使用锗直径25mm（GE）窗口。它的高折射率造成不良的强度损失，用葛滤波器抗反射涂层在很大程度上避免。 降温MCT探测器杜瓦瓶液氮。注意：使用的光伏MCT检测器优于photoconductives因为它们的线性响应，因此，优于photometrIC的精度和可靠性的基准31,53。 预浓缩用于实验，以至少2毫克蛋白/毫升的低的缓冲液（<20毫摩尔）的离子强度，以防止形成盐晶体，同时干燥该蛋白悬浮液，形成均匀的膜蛋白质的样品。对于沉积物样品，洗/应用超速离心（ 例如 ，膜蛋白在脂质体或细胞膜补丁）集中起来。使用适当的截止centricons的蛋白质，不沉淀物（ 如洗涤剂溶解膜蛋白）。 为获得最佳效果，请使用：1）蛋白制剂和纯粹的，活跃成为可能; B）脂/蛋白比值≤重量3在细胞膜补丁或再造在脂质体中的蛋白质;三）清洁剂/蛋白比值≤1的重量为洗涤剂溶解蛋白质。避免使用清洁剂或脂质，其振动谱带与蛋白质（ 例如 ，CHAPS）的重叠。 </oL> 2， 细菌视紫红制备衰减全反射实验安装ATR附件进入FT-IR光谱仪的样品室。注意：我们使用的ZnSe /钻石ATR与5活跃的反射。避免半导体材料，例如锗或硅作为ATR附件的内反射元件（IRE），因为它们的光学性能受激磁可见激光。 测量宽范围（约4,000-800厘米-1）能谱在4 cm-1处的清洁爱尔兰表面由传统的快速扫描傅立叶变换红外光谱仪的分辨率。使用此光谱作为参考光谱来计算吸收光谱在稍后的阶段。 覆盖ATR的IRE表面与20μl后用再水合的样品（ 例如 ，4M NaCl和100mM的NAPI，在pH 7.4）的缓冲液中。测量缓冲器的IR吸收。 除去缓冲液，并冲洗爱尔兰表面的Wi次水。避免接触表面。通过强烈的气流从爱尔兰表面去除残留的液体。 在爱尔兰表面（约0.2 平方厘米面积）的顶部蔓延〜3微升细菌视紫红质（BR）在紫膜（〜6 mg蛋白/ ml的去离子水）。干燥该蛋白悬浮液下的干燥空气吹干直至膜达到。 测定干燥膜的吸收光谱（ 见图1）。 轻轻地添加20-40微升的高离子强度的再水合干燥的薄膜（ 例如 ，4M NaCl和100mM的NAPI，在pH 7.4）的缓冲液中。注意：高离子强度可防止膜膜的过度溶胀，允许保留尽可能多的蛋白质尽可能靠近被探测的表面（ 图2）。 覆盖ATR架有盖，防止水分蒸发。任选地，将一个盖护套连接到循环浴设定为25℃的温度控制。对于长photocycles（＆＃蛋白质62，秒），温度控制可能会增加基线稳定性。 测量的吸收光谱。估计样品的膜中减去缓冲液的吸收光谱（ 图3），再水化后残留的表面附近的百分比。 确认影片通过记录吸收光谱在补液后5-20分钟的间隔（ 图4）肿胀的稳定。这一步是可选的，但建议。 3，执行对洗涤剂溶解的Channelrhodopsin-2传输实验 加10微升的ChR2（〜10毫克蛋白质/毫升）溶解于5 mM氯化钠，5mM的HEPES（pH7.4）和癸基-麦芽糖苷（DM）在20mm直径的氟化钡窗口的中心。用微量移液器尖端的帮助下，以一个6-8毫米直径铺（〜200微克/平方厘米的蛋白质表面密度2）。 形成薄膜USI纳克的干燥空气水流平缓。为了达到最佳效果，确保薄膜是均匀的，并且其直径在最大孔径大致匹配的红外光束的大小。 通过将3-5微升甘油/水分布在3-5滴周围的干膜的混合物，并紧紧地贴着它与第二个窗口使用平面硅树脂O形圈的≥1毫米厚度水化膜。注意：在甘油/水混合物的比例控制窗54之间的相对湿度。对于吸湿性示例使用一个3/7或2/7甘油/水比（W / W）。的甘油/水滴不应该与蛋白质膜直接接触。 插入支架的氟化钡夹窗口。从通过用红外线不透明的材料，如纸，有孔相匹配的水合的膜的尺寸覆盖了样本窗口到达检测器防止直光。将支架在样品室。 控制保持的温度为25°下通过一个恒温夹套连接到一个温度控制的循环浴中。 测定吸收光谱。保证在酰胺I区的最大吸收（〜1,700-1,620厘米-1）是在0.6-1.0的范围内。 使用参考消光系数谱的水，DM，并代表的膜蛋白（ 图6）估计的质量和蛋白质/剂/水的摩尔比从水合的膜的吸收光谱（ 图5）。 等到水化程度进行步进扫描实验（≥1小时）前稳定。 4，调整了令人兴奋的激光和同步 对bR的实验使用脉冲Nd的二次谐波发射：YAG激光器（λ= 532纳米）来触发光周期。对于涉及的ChR2的实验中，用λ= 450nm的激发通过一个运算所提供tical参量振荡器（OPO）由一个钕的三次谐波（λ= 355纳米）：YAG激光器。确保激光脉冲足够短（〜10毫微秒），以最小化二次光激发。注意：激光脉冲的能量应尽可能保持恒定。在我们的设置中，激光强度波动≤10％左右的平均值，并经测量激光的反射由连接到一个瞬态记录器的光电二极管和集成的响应（ 图8）。 情侣激光在样品上。调整激光在样品上的能量密度，以使用功率计2-3毫焦耳/厘米2每脉冲。 在ATR设置，使用光纤放在头顶上的ATR盖的。 用于传输的实验中，使用反射镜使激光在样品和如果需要，镜片要么准直或发散的激光束的直径稍微高于试样膜的大小。 落色同步r型光谱仪脉冲数据记录。使用Nd组成的电子器件的Q开关同步输出的TTL脉冲：YAG激光器来触发分光计。设置钕的激发率：YAG激光，以10赫兹的Br和0.25赫兹的ChR2，分别。 使用一个脉冲延迟发生器（PDG）来控制激光激发速率，如果钕的重复率：YAG激光器是不容易调整的。 灯同步输出的钕连接：YAG激光对PDG外部触发输入。该PDG提供〜190微秒延迟的TTL脉冲输出到Q开关同步的钕输入：YAG激光器来触发激射。门的PDG接受外部触发后，才自最后一次接受的触发器（100毫秒Br或4秒，CHR 2）一定时间。 5，时间分辨步进扫描准备和设置放置一个低通滤光器在光路中。要执行在1,800-85时间分辨步进扫描测量0厘米-1的光谱范围内，可以使用一个滤波器不透明以上1950厘米-1，低于1800厘米-1（ 图7）良好的传输（> 50-80％）。 探测器从改变AC至DC耦合模式。注意：在此之后调整干涉信号将不再摆动围绕零但周围被称为DC-电平的值。 使用分光计的最大可能光束孔径为高光子通量，因此，更好的信号 – 噪声，但在检测器的线性度的限制。 把干涉图的DC电平为零，调整电子增益，以更好地利用模拟数字转换器（ADC）的动态范围。实现DC-电平通过施加电压偏压至由前置放大器提供的信号偏移。注意：此选项中包括现代的FT-IR光谱仪。否则，可以使用自制的外部设备来代替，放置在前置放大器和ADC 38之间。护理是那么需要确保这种设备的电子产品的快速和线性。 启动的FT-IR光谱仪的步进扫描菜单。设置目标光谱带宽为步进扫描测量1,975.3-0厘米-1。调整频谱带宽的He-Ne激光的波数（在本例中的1/8 个 ）的一小部分，稍微超过该光学滤波器的截止。 禁用任何高通电子滤波器，以防止动力学的扭曲在稍后的时间。一个低通电子滤波器可以是有益的，当其截止频率为顺序或以上的ADC（降低噪声混叠）的采样率。 谱和相位分辨率设置为8 -1至64 -1，分别。前锋设置干涉采集模式为单端。有了这些选项之一干涉大约需要500点。 ADC的采样速率设置为可用的最高的光谱仪（ 例如 ，160 KHz或6.25微秒）。设置“触发实验”到“外部”， 即激光是主人。设置要被记录的线性间隔的数据点的数目：7,000 BR（最多42毫秒）和20,000的ChR2（最多125毫秒）。注：较长的时间尺度可以不使用准对数时间间隔外部TTL脉冲从波发生器来触发数据采集38溢出ADC的内存被覆盖，或者使用两个平行瞬态记录作为内部ADC 31的替代品， 32。 保存约100预触发点作为供试品的暗状态的参考。注意：在毫秒时间尺度的数据质量往往是在移动镜子波动有限。增加高于100的预触发点，因此，预计不会显著提高数据质量。 设置共同增加的数量， 即每个镜像断定该光反应的平均次数离子。对于BR，使用20个合作增加（测量时间为10 Hz激励，税率为20分钟）。对于ChR2的使用2合加（测量时间为0.25赫兹激励率达70分钟） 重复实验10倍的Br和35倍三种不同的样品薄膜的ChR2，有终于〜200合作，每增加后视镜位置。 6，数据处理通过比较由所述第一和最后一次测量得到的光致IR差异谱证实样品的状态。考虑丢弃其中的差异谱的强度下降到低于所述第一测量的60％的任何量测。 平均记录的干涉。 使用从FTIR光谱仪的OPUS软件中选择的时间分辨干涉来平均，并将其添加到“频谱计算器”。 点击“=”来获得干涉的平均值。 注意：当干涉图的相位是恒定的测量是淡漠平均干涉或单通道谱中。恒定的相位可以通过计算和相位谱的第一个和最后一个记录的干涉比较来证实。 进行平均化时间分辨干涉图的傅立叶变换，得到平均时间分辨单个信道的光谱。 使用相同的软件，如步骤6.2.1，选择平均时间分辨干涉，并点击“干涉到光谱”的图标。使用默茨相位校正方法，是2的零填充因数（每器乐分辨率两个数字点），并切趾函数（ 例如 ，三角形，Blackmann哈里斯-3 -条款等）。 单击底部的“转换”，改造时间分辨干涉到时间分辨光谱。 导出的时间分辨单个信道的数据作为一个“数据点表”或“; matlab的“使用文件中的”另存为“，在OPUS软件图标。继续在一个外部程序的数据处理。 一般的单信道的光谱的激光之前，与时间分辨单个信道的数据转换成时间分辨吸收差谱。 激光前的100个单信道的光谱的计算的预期噪声标准偏差的差示光谱作为波数（ 图12）的功能的载体，使用该噪声标准偏差，ε和平均，S 0（ν）： ε/ S 0（ν）。估计ε的值减去连续的单声道谱和计算√2校正标准偏差。 删除光谱区域太吵被使用（ 例如 ，上述1825厘米-1，低于850 -1）。 执行一个准对数求均（ 例如 ，20光谱/时间十年）。该appearan数据的CE将改善和光谱的数目会由10〜4降至〜10 2没有丢失任何显著信息（ 图9）。 使用傅立叶插值点增加四倍的谱密度（以1点/厘米-1）（上传零填充）。 注：我们在执行在MATLAB中运行自制程序的步骤6.4.1至6.4.4。 处理所获得的时间分辨光谱（ 图10A）与奇异值分解，奇异值分解，（ 图13）。通过与显著SVD分量（ 图10B）有限数量的数据重建完成数据去噪。注意：我们在MATLAB中进行奇异值分解，使用内置的“SVD”功能。