Behavioral Fenotipizzazione di modelli di malattia murini con la stazione Integrated Behavioral (INBEST)
Summary
Monitoraggio prolungato e completo di topi in un ambiente home-cage fornisce una più profonda comprensione dei comportamenti problema in modelli murini di patologie del cervello. Questo articolo descrive la stazione Behavioral Integrated (INBEST) come componente chiave di analisi comportamentale contemporaneo.
Abstract
A causa di rapidi progressi nel campo dell'ingegneria genetica, piccoli roditori sono diventati i soggetti preferiti in molte discipline della ricerca biomedica. In studi di disturbi cronici del sistema nervoso centrale, vi è una crescente domanda di modelli murini con alta validità a livello comportamentale. Tuttavia, molteplici meccanismi patogeni e deficit funzionali complesse spesso impongono sfide per misurare in modo affidabile e interpretare il comportamento dei topi malati cronici. Pertanto, sono necessari la valutazione della patologia periferico e un profilo comportamentale in diversi punti temporali usando una batteria di test. Video-tracking, spettroscopia comportamentale, e l'acquisizione a distanza di misure fisiologiche sono tecnologie che consentono un'analisi completa, accurata e imparziale comportamento in un ambiente home-base-simile emergendo. Questo rapporto descrive un protocollo fenotipizzazione raffinata, che comprende un apparato di monitoraggio su misura (Stazione comportamentale integrato, INBEST) che si concentra su misurazioni prolungate di bauscite funzionali sic, come l'attività spontanea, cibo / assunzione di acqua e il comportamento motivato in un ambiente relativamente priva di stress. I miglioramenti tecnici e concettuali nel design INBEST possono promuovere ulteriormente la riproducibilità e la standardizzazione degli studi comportamentali.
Introduction
Progressi rapidi in ingegneria genetica nel corso degli ultimi decenni hanno portato ad una proliferazione senza precedenti di modelli animali di malattie umane. I topi hanno acquisito lo status di soggetti sperimentali primarie in scienze biomediche per diversi motivi. Dal punto di vista pratico, hanno un tasso di riproduzione ad alta, sono relativamente poco costoso, e sono facili da alloggiare. Da un punto di vista concettuale, sono geneticamente vicino agli esseri umani, possono essere geneticamente modificati con relativa facilità, e hanno endocrino, immunitario e nervoso altamente sviluppata. Oltre alle lesioni a livello genetico e cellulare, studi contemporanei di disturbi cerebrali richiedono la dimostrazione del deficit replicabili funzionali che evidenziano viso, costruire, o validità predittiva di un nuovo modello di topo 1.
Un'infezione acuta in un mammifero homoeothermic traduce spesso in risposta febbrile, che insieme con il comportamento di malattia, costituisce uno degliprincipali meccanismi di sopravvivenza 2. Acutamente animali malati mostrano alterazioni significative nel cibo / assunzione di acqua e le prestazioni in compiti riflettenti di reattività emozionale, comportamento esplorativo, e capacità di apprendimento / memoria. Queste modifiche in gran parte rappresentano ridotta attività sessuale / sociale e la conservazione di energia per reazioni immunitarie di difesa. Tuttavia, quando le condizioni acute girare cronica (come si vede in molti immunologiche, endocrine e malattie neurologiche), prestazioni comportamentale può ulteriormente peggiorare a causa di danni strutturali di vari organi, compreso il cervello 3.
Malattie neurodegenerative umane e animali sono spesso accompagnate da una costellazione di deficit neurologici e comportamentali. Pertanto, uno scopo fondamentale negli studi comportamentali degli animali cronicamente malati è distinguere effetti centrali dei deficit indotti da sintomatologia periferico. Tuttavia, la durata relativamente breve dei compiti comportamentali standard, limita la collettaion di informazioni sulle misure funzionali di base, come l'olfatto, riposo, il sonno, il cibo / assunzione di acqua, o episodi epilettici. L'inclusione di queste misure migliora profilazione comportamentale e permette una migliore interpretazione delle performance in compiti di attività esigenti.
Perfezionamenti in fenotipizzazione comportamentale di topi malati
Le carenze nella valutazione del profilo comportamentale di topi malati hanno reso necessario il monitoraggio continuo di topi singolarmente-ospitati dai PC in rapida trasformazione. Anche se diverse batterie comportamentali possono essere progettati 4, 5, elencate di seguito sono le procedure che sono stati utilizzati per stabilire con successo un modello animale di lupus neuropsichiatrico 6. Questa batteria è ripetutamente applicato in entrambi i modelli sub-cronica e cronica della malattia (Figura 1), come ad esempio decadimento cognitivo lieve e malattia di Alzheimer 7. Dopo una serie di test neurologici 8-10, acApparecchiatura ustom misura, progettato per soddisfare le esigenze di cui sopra utilizzando il monitoraggio continuo delle uscite multiple comportamentali in un ambiente domestico-gabbia arricchito, può essere impiegato. Questo approccio basato su etologico alla valutazione di attività esplorativa spontanea e comportamento motivato fornisce una comprensione più completa dei deficit di performance in altri paradigmi, come quelli riflettente di apprendimento e memoria.
Figura 1. Rappresentazione schematica di fenotipizzazione comportamentale longitudinale nel nostro laboratorio. La batteria comportamentale è progettata per evolvere da Lessing verso più- compiti stressanti, che si ripetono in diversi momenti per valutare gli effetti di fattori sostenuti, come la progressione della malattia, trattamento farmacologico , o reazioni immunologiche. Test INBEST e individuali vengono eseguite durante la p scuroHase, spesso over 10 e 2 ore, rispettivamente, abbreviazioni:. R – riflessi; BW – Beam Test Walking; RR – rotarod; OT – test olfattivi; SP – Test Preferenza saccarosio; SD – Step Down test; NO – Test Object Romanzo; OF – Test in campo aperto; SAB – spontaneo Alternanza Behavior; FS – test di nuoto forzato; MWM – Morris Water Maze. * – Gli aspetti della prova (ad esempio, l'ubicazione, il contesto, colore, forma) che devono essere modificati nel corso degli studi successivi per tutta corso dell'esperimento.
Continuo di video-registrazione e l'analisi del comportamento in un ambiente home-gabbia sono stati segnalati nel 2007 11. A più complesso apparato automatizzato che integra test comportamentali utilizzati negli studi con i topi autoimmune è stato presentato al 'Comportamento misura' incontrare un anno dopo 12. La stazione comportamentale integrato (INBEST, Figura 2A) è un sistema modulare, che comprises di uno stimolo leggero riparo, computer controllato, due lickometers fotocellula controllati (uno per l'acqua, una per una soluzione di interesse), un distributore automatico di cibo, una ruota in esecuzione computerizzato, e una maglia arrampicata digitalizzato. Latenze, le frequenze e le durate di comportamenti specifici vengono esaminati con il software personalizzato. Locomotore e l'attività esplorativa (ad esempio, di un oggetto o di un romanzo conspecifici non familiare) può essere valutata con il software di video-tracking (Elenco dei materiali / attrezzature), durante il sonno e dei modelli comportamentali meno frequenti, come il comportamento autolesionistico e convulsioni, può essere segnato manualmente con il software di video-tracking o pacchetti evento-registrazione dedicati. Otto completi configurazioni INBEST / video vengono utilizzati, permettendo il controllo simultaneo di 4 animali sperimentali e di controllo 4 (Figura 2B).
<img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51524/51524fig2.jpg" />
Figura 2. La stazione comportamentale integrato. (A) Rappresentazione schematica di hardware e software utilizzati nella progettazione di una scatola INBEST (L = 39 x W = 53 x H = 50 cm). (B) Otto scatole INBEST complete offrono l'opportunità di concomitante monitoraggio domiciliare-gabbia di quattro topi sperimentali e quattro di controllo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Variabili dipendenti comprendono misure di assunzione di cibo / acqua, la risposta alla stimolazione appetibile, l'attività ambulatoriale spontanea, arrampicata, corsa volontaria, i comportamenti legati all'ansia (ad esempio, l'esplorazione di nuovi oggetti), governare, cogliendo e dormire. Inoltre, gli stimoli visivi possono essere presentati per il condizionamento e di apprendimento paradigmi. I vantaggi di INBEST oltre test comportamentali di serie comprendono l'eliminazione di confondimento Induc effetticato da stress del trasporto, così come continua, la raccolta automatizzata di misure riflettenti di attività notturna, l'esplorazione, l'ansia legate e comportamenti depressivi-like. L'integrazione di componenti hardware sensibili con un pacchetto di video-tracking produce una ricchezza di informazioni, che consente una migliore valutazione del comportamento in relazione alla progressione di malattia cronica in modelli animali diversi. INBEST può essere usato per studiare altri disturbi cronici del sistema nervoso centrale (ad esempio, l'autismo, depressione maggiore, schizofrenia), così come in studi longitudinali concentrandosi su sviluppo neurologico, effetti comportamentali di disturbi sistemici / neoplastica, e farmacoterapia prolungata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il rilevamento di effetti funzionali in animali dipende in gran parte dalla capacità del ricercatore di limitare la variabilità intrinseca di studi comportamentali. Pertanto, è importante meticolosamente controllo e minimizzare i potenziali confondenti che possono ridurre l'affidabilità e riproducibilità dei dati comportamentali. Allo stesso tempo, è importante rilevare che nessuna prova riflette un singolo dominio di comportamento, che la conoscenza della funzione neurologica è obbligatorio, e che il comportamento è molto sensibile a fattori di stress esterni. Se i postulati di cui sopra sono apprezzati, si può concludere che l'analisi comportamentale globale dovrebbe includere l'andamento nel tempo della risposta misurata, così come, coinvolgere i tratti funzionali di base e paradigmi che tap in aspetti comportamentali specifici. Molti di questi criteri possono essere soddisfatti utilizzando la valutazione computerizzata dei movimenti e atti comportamentali in un ambiente home-cage arricchito.
Finora, è stato Emphasized fenotipizzazione che comportamentale di modelli murini di warrants malattie umane considerazioni aggiuntive. Questo concetto si basa sulla premessa che omeostasi funzionale è contestata da fattori stressanti interni ed esterni durante l'insorgenza della malattia. Anche se tutti confonde potenziali non possono essere eliminati con l'introduzione di automatizzato, casa-gabbia fenotipizzazione, le questioni relative alle impostazioni incoerenti ambientali, lo stress del trasporto e la movimentazione ripetuta sono ridotti al minimo. Questo migliora notevolmente la coerenza e la precisione negli studi; anche piccole riduzioni variabilità possono migliorare il rilevamento degli effetti indotti da una malattia incipiente. Infatti, INBEST offre una ricchezza di informazioni, che consente una valutazione più accurata della insorgenza, cinetica, e la gravità dei cambiamenti comportamentali, così come le relazioni importanti tra i vari deficit comportamentali malattia indotta. Affidabile video tracciamento dipende da due condizioni di illuminazione. Innanzitutto, la luce diffusa è necessaria nella camera di prova per impediremanufatti da oggetti vicini riflettenti. In secondo luogo, elevato contrasto colore può essere ottenuto scegliendo un colore piano opportuno differire dal colore soggetto il più possibile. Nel nostro laboratorio, questo è realizzato utilizzando alluvione luci posizionate sotto le scatole e vassoi INBEST pavimento nero durante il monitoraggio topi albini (sfondo bianco o grigio sarebbe sufficiente se testare i ceppi pigmentati). Per quanto riguarda l'aspetto di registrazione degli eventi del INBEST, l'impostazione hardware corrente (1 scheda video Piccolo con 4 ingressi) limita 4 scatole essere utilizzate simultaneamente per PC. Questo è piuttosto piccolo numero di caselle, mentre un più adatto set-up richiederebbe 8 o addirittura 16 gabbie, e quindi 2 o 4 PC, rispettivamente. Preferibilmente, INBEST può essere utilizzato in modo continuativo per 24 ore come la casa-gabbia. Ciò consentirebbe animali abituano pienamente l'ambiente e stabilire, modelli comportamentali circadiani stabili, che possono essere analizzati in modo imparziale. Per evitare la perdita di dati del computer a causa di un'interruzione di corrente, una potenza continua suPPLY (o almeno un gruppo di continuità) devono essere fissati. Infine, per garantire la corretta valutazione della alimentazione quotidiana, va osservato che le dimensioni del pellet alimentari non deve superare la dimensione dei fori del dispenser cibo (la dimensione consigliata di una singola pastiglia cibo è 20 mg).
Essa non deve essere trascurato, tuttavia, che questa analisi dovrebbe anche includere come differenti misure INBEST possono interagire con l'altro. Ad esempio, i topi che spendono più tempo nella ruota corsa rischiano di ingerire maggiori quantità di cibo e acqua per soddisfare le loro crescenti richieste caloriche. Allo stesso modo, i topi ingestione più soluzione di saccarosio possono ridurre la loro assunzione di cibo. L'interpretazione di questi risultati può essere ulteriormente complicata dal miglioramento generale delle prestazioni nel tempo, in particolare con riferimento a Ingestive comportamento e funzionamento dell'attività della ruota. Data la loro incentivazione-proprietà, sperimentatori possono anche prendere in considerazione la limitazione dell'accesso alla soluzione di saccarosio e tegli correre ruota per contrastare il rischio di effetti di post-ingestive e eccessiva perdita di peso, rispettivamente. Tuttavia, queste preoccupazioni possono essere più rilevanti in alcuni ceppi di altri a causa diversi ceppi di topi hanno profili comportamentali dissimili. Nonostante sia funzionante sia di base e controlli di valutazione sperimentale per molte delle questioni di cui sopra, gli sperimentatori devono riconoscere che queste variabili devono essere prese in considerazione quando si interpretano i dati INBEST. Allo stesso tempo, alcuni aspetti del comportamento non possono essere studiati in ambiente domestico gabbia, necessitando quindi una combinazione con test standard per completare il profilo del comportamento dei soggetti.
Monitoraggio computerizzato all'interno standardizzato, ma ambienti flessibili sembra essere il prossimo passo logico in analisi comportamentale contemporaneo. Tale non invasivo, approccio basato etologicamente permetterà ai ricercatori di osservare il repertorio di risposte comportamentali per un periodo prolungato di tempo. Iloretically, questo può essere ottenuto studiare il comportamento in un ambiente arricchito "virtuale" che assomiglia molto un habitat naturale. Diversi gruppi di ricerca hanno descritto gli strumenti di monitoraggio di visione-based che supportano fenotipizzazione comportamentale di topi nella loro 22-25 in casa gabbia, in diadi 26, 27, o nel contesto dei grandi gruppi sociali 28. Alta precisione e risoluzione spaziale possono essere realizzati integrando video tracciamento con microchip per la raccolta simultanea e sincronizzata di dati comportamentali in un gruppo di topi 28. Telecamere termografiche in grado di rilevare calore firme possono essere combinati con microchip impiantabili o transponder per fornire la posizione relativa e le funzioni fisiologiche di base di ogni mouse (ad esempio, la temperatura del corpo, del cuore / frequenza respiratoria). Inoltre, il sistema di tracciatura 3D advanced produrrebbe riconoscimento più accurato e quantitativa di atti comportamentali. Per eseguire ripetutamente variety di test, un tale sistema dovrebbe essere automatizzato, controllato a distanza, e modulare. Ad esempio, la memoria spaziale può essere studiata in ambienti di grandi dimensioni programmando la comparsa di segnali distali sulle pareti LCD, o presentando / nascondere distributori di cibo appetibile da fondi mobili. In modo simile, nuovi oggetti potrebbero essere presentati / nascosta in momenti specifici durante lo studio. Tale fenotipizzazione computerizzato può aiutare a chiarire i determinanti genetici del comportamento, meccanismi patogenetici modelli malattia di base, e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Se il consenso è raggiunto rispetto alle condizioni di prova, la sequenza di test, così come l'hardware e il software utilizzato, ci si può aspettare che la normalizzazione tanto atteso migliorerebbe la riproducibilità di studi comportamentali e di elevare psicometria sperimentali ad un nuovo livello.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Ontario Mental Health Foundation grant to B.S, and an Ontario Graduate Scholarship to M.K.
Materials
| Power control interface operating package | Med Associates Inc. | MED-SYST-8 | Interface box and PCI card that manage all A/D data inputs and outputs |
| Stimulus light | Med Associates Inc. | ENV-221M | 28 V DC, 100 mA, 2.5 cm diameter light (for presentation of a conditioned stimulus) |
| Head entry detector | Med Associates Inc. | ENV-254-CB | Permits head entry detection into the pellet receptacle |
| Photobeam lickometer | Med Associates Inc. | ENV-351W | Infrared sensor system for detecting beam interception by snout |
| Food pellets | Bio-Serv | F0163 | Dustless precisions food pellets (20 mg rodent grain-based diet) |
| Food dispenser | Med Associates Inc. | ENV-203-20 | Automated food dispensing system consisting of elevated plastic container and dispensing tube |
| Food receptacle | Med Associates Inc. | ENV-303R2W | Infrared sensitive base to signal when food pellet is dispensed or collected |
| Climbing mesh | Med Associates Inc. | CT-Climbing mesh | Durable metal rungs, dimensions |
| Med PC IV software | Med Associates Inc. | SOF-735 | Integrates data acquisition from all electronic devices |
| MPC2XL v1.4 | Med Associates Inc. | SOF-731 | Raw data transfer utility |
| Soft CR Pro v1.05 | Med Associates Inc. | SOF-722 | Remote online monitoring software |
| Running wheel | Med Associates Inc. | CT-MSUB-ENV-3042-X1 | Activity wheel for mice |
| Digital counter | Med Associates Inc. | ESUB-ENV-3000 | LCD counter (4 counts = 1 revolution = 54.6 cm length) |
| Picolo Diligent frame grabber | Euresys | High-resolution PCI video capture card | |
| Ethovision XT 8.5 | Noldus Information Technology | Video-tracking software | |
| Camera | Panasonic | WV-BP334 | Digital, low-lux video camera suspended from a custom-made metal stand |
| Video Splitter | American Dynamics | ADQUAD87 | Integrates and digitizes inputs from 4 video cameras |
References
- Henn, F. A., McKinney, W. T., Meltzer, H. Y. Ch. 67. Psychopharmacology: The Third Generation of Progress . , 687-695 (1987).
- Hart, B. L. The behavior of sick animals. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 21, 225-237 (1991).
- Kapadia, M., Sakic, B. Autoimmune and inflammatory mechanisms of CNS damage. Prog. Neurobiol. 95, 301-333 (2011).
- Rogers, D. C. Behavioral and functional analysis of mouse phenotype: SHIRPA, a proposed protocol for comprehensive phenotype assessment. Mamm. Genome. 8, 711-713 (1997).
- Moy, S. S. Mouse behavioral tasks relevant to autism: phenotypes of 10 inbred strains. Behav. Brain Res. 176, 4-20 (2007).
- Gulinello, M., Putterman, C. The MRL/lpr mouse strain as a model for neuropsychiatric systemic lupus erythematosus. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 207504 (2011).
- Marchese, M. Autoimmune manifestations in the 3xTg-AD model of Alzheimer’s disease. J. Alzheimers. Dis. 39, 191-210 (2014).
- Sakic, B. A behavioral profile of autoimmune lupus-prone MRL mice. Brain Behav. Immun. 6, 265-285 (1992).
- Sakic, B., Szechtman, H., Denburg, S. D., Carbotte, R. M., Denburg, J. A. Spatial learning during the course of autoimmune disease in MRL mice. Behav. Brain Res. 54, 57-66 (1993).
- Sakic, B. Disturbed emotionality in autoimmune MRL-lpr mice. Physiol. Behav. 56, 609-617 (1994).
- Visser, L., van den Bos, R., Kuurman, W. W., Kas, M. J., Spruijt, B. M. Novel approach to the behavioural characterization of inbred mice: automated home cage observations. Genes Brain Behav. 5, 458-466 (2006).
- Sakic, B. The use of integrated behavioral station in chronic behavioral studies. Measuring Behavior. , 328 (2008).
- Shinzawa, K. Neuroaxonal dystrophy caused by group VIA phospholipase A2 deficiency in mice: a model of human neurodegenerative disease. J. Neurosci. 28, 2212-2220 (2008).
- Quintana, A., Kruse, S. E., Kapur, R. P., Sanz, E., Palmiter, R. D. Complex I deficiency due to loss of Ndufs4 in the brain results in progressive encephalopathy resembling Leigh syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10996-11001 (2010).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Crawley, J. N. . What’s Wrong With My Mouse?: Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , (2007).
- Feeney, D. M., Gonzales, A., Law, W. A. Amphetamine, haloperidol and experience interact to affect rate of recovery after motor cortex injury. Science. 217, 855-857 (1982).
- Stanley, J. L. The mouse beam walking assay offers improved sensitivity over the mouse rotarod in determining motor coordination deficits induced by benzodiazepines. J. Psychopharmacol. 19, 221-227 (2005).
- Gulinello, M., Chen, F., Dobrenis, K. Early deficits in motor coordination and cognitive dysfunction in a mouse model of the neurodegenerative lysosomal storage disorder, Sandhoff disease. Behav. Brain Res. 193, 315-319 (2008).
- Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behav. Brain Res. 141, 237-249 (2003).
- Kapadia, M. Altered olfactory function in the MRL model of CNS lupus. Behav. Brain Res. 234, 303-311 (2012).
- Jhuang, H. Automated home-cage behavioural phenotyping of mice. Nat. Commun. 1, 68 (2010).
- Steele, A. D., Jackson, W. S., King, O. D., Lindquist, S. The power of automated high-resolution behavior analysis revealed by its application to mouse models of Huntington’s and prion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1983-1988 (2007).
- Zarringhalam, K. An open system for automatic home-cage behavioral analysis and its application to male and female mouse models of Huntington’s disease. Behav. Brain Res. 229, 216-225 (2012).
- Chaumont, F. Computerized video analysis of social interactions in mice. Nat. Methods. 9, 410-417 (2012).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nat. Methods. 10, 64-67 (2013).
- Weissbrod, A. Automated long-term tracking and social behavioural phenotyping of animal colonies within a semi-natural environment. Nat. Commun. 4, 2018 (2013).
