Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Jan Lipfert; Mina Lee; Orkide Ordu; Jacob W. J. Kerssemakers; Nynke H. Dekker

doi:10.3791/51503

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Bioengineering

트위스트와 토크의 측정을위한 자석 집게

Published: May 19, 2014

doi:

10.3791/51503

Jan Lipfert¹, Mina Lee¹, Orkide Ordu¹, Jacob W. J. Kerssemakers¹, Nynke H. Dekker¹

¹Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience,Delft University of Technology

Summary

마그네틱 핀셋, 강력한 단일 분자 조작 기술은 생물학적 거대 분자에 (자기 토크 핀셋 칭했다 구성을 사용하여) 및 토크 (자기 핀셋을 자유롭게 선회 불리는 구성을 사용하여) 꼬임의 직접적인 측정을 위해 구성 될 수있다. 이러한 측정을 수행하기위한 지침은 DNA 및 관련 nucleo 단백질 필라멘트의 연구에 응용 프로그램을 포함하여 제공됩니다.

Abstract

단일 분자 기법은 가능한 실시간 용액 개체 생물학적 분자의 거동을 조사한다. 이 기술은 원자 힘 현미경 같은 소위 힘 분광 방법, 광학 핀셋, 스트레칭 흐름, 자기 핀셋 있습니다. 이러한 접근 방법 사이에, 자기 핀셋 일정한 스트레칭 힘을 유지하면서 토크를 적용 할 수있는 능력으로 자신을 구별했다. 여기서, 예시 된 방법과 같은 "종래의"자기 핀셋 실험 구성은, 횡 필드의 크기를 최소화하기 위해 해당 필드 구성의 간단한 변형을 통해, 생체 분자의 비틀림 정도를 측정하도록 구성 될 수있다. 결과 구성은 자유롭게 궤도 자기 핀셋이라고한다. 또한,이 필드 구성의 다른 변형은 위 및 그 사이의 중간 크기를 갖는 횡 필드를 얻을 수있는 방법을 나타낸다8220; 기존의 "자기 족집게 가능 직접 생물학적 분자에 저장된 토크를 측정 할 수 자유롭게 궤도 자기 핀셋. 이 구성은 자기 토크 핀셋이라고한다. 첨부 된 동영상을 자유롭게 궤도 자기 핀셋 및 자기 토크 핀셋으로 종래의 자기 핀셋의 변환을 수행 할 수있는 방법에 대해 자세히 설명하고, 이러한 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 매우 강력한 악기의 다양성을 확대하면서 이러한 적응은 종래의 자기 핀셋의 모든 장점을 유지한다.

Introduction

최근 몇 년 동안, 단일 분자 기술은 반응 속도와 기본 mechanochemistry에 대한 통찰력을 산출 processive 모터 단백질 및 기타 효소의 연구에 자신의 폭 넓은 적용 가능성을 입증했다. 포스 분광법의 맥락에서, 중요한 기여는 원자 힘 현미경 연신 유동, 광학 및 자기 핀셋으로되었습니다. 광학 및 자기 핀셋 (MT)이 특히 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 분자 조작의 측면에서 유연성을 결합에 성공했다. 여기에서, 우리는 표면과 초상 자성 구슬 ^1-3 사이에 닿는 생물학적 분자에 모두 스트레칭 힘 및 토크를 적용 할 수있는 MT에 초점을 맞 춥니 다.

마그네틱 핀셋 (MT,도 1a) 기계적 핵산의 특성뿐만 아니라, 단백질과의 상호 작용 모두를 모니터하기 위해 사용 된 매우 다양한 단일 분자 기법이다. MT는 많은 힘이전체 단순성과 견고성 실험 구현, 토크의 손쉬운 응용 프로그램, 자연의 운영 및 일정한 힘 모드 ⁴ 간단 교정, 측정 ^{5, 6} 병렬 확장 및 샘플 가열 및 광 손상의 유무를 포함하여의. 다른 단일 분자 접근법에 비해 MT는 ≈ 10 fN의 최저의 힘에 힘 – 의존성 측정을 수행하고 똑 바르게 supercoiling의 정도를 제어 할 수있는 능력을 가질 수있는 방법을 제공한다. 이동 단말은 주로 핵산 ^{(7, 8)을} 포함하는 생물학적 과정을 조사하는 실험 도구로서 사용되었지만, 그들은 또한 단백질 ^9-13 또는 셀 ^{(10), 14-17의} 기계적 특성의 연구에서 애플리케이션을 발견했다. 수많은 유용한 참조 MT ^{4, 18 ~ 20를} 빌드하고 실행하는 방법에 대해 설명이 가능합니다.

Howev어, 기존의 MT는 토크를 적용하면서, 그들이 직접 토크를 측정하지 않고 직접 회전 운동을 추적하고 있지 않습니다. 또한, 그들은 핵산 테더의 자유 회전을 제한. 여기, 우리는 자석 핀셋 두 확장을 제시한다. 우선, 칭했다 자유롭게 선회 자기 핀셋 (FOMT,도 1B) ^(21)는, 허용 테더 축 주위의 회전 운동을 구속하지 않고 평형 각도 변동과 닿는 핵산 분자의 트위스트 변화 측정. 두 번째는, 자기 토크 족집게 단일 생체 분자 ^{22 ~ 27에} 모두 힘과 토크를 적용하고 직접 측정 할 수있는 기능이 있습니다 (MTT, 그림 1C)을,라고.

다음과 같은 프로토콜에서, 우리는 독자가 그 / 그녀의 처분 '기존의'MT 악기에 있음을 가정. 우리는 빌드하고 실행 설정 MT를,뿐만 아니라 방법에 대한 참조에 대한 토론에 독자를 참조 conside자석 구슬, 자석 및 추적 루틴의 선택에 고려되어야한다 식량. 또, 부분 (1) 및 프로토콜 본문이는 우리가 일반적으로 준비하고 MT에 사용하기위한 DNA 샘플뿐만 아니라 종래의 MT에서 단일 DNA상에서 수행 될 수 예비 측정을 배양하는 방법을 설명한다. 프로토콜 텍스트 섹션 3과 4는 MT 악기 쉽게 적응 FOMT 및 MTT 측정에 사용 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Protocol

DNA 샘플 1. 준비 및 창업 보육 각각 18 여러 비오틴과 제닌 그룹으로 작용하는 끝을 (일반적으로 ≈ 600 bp의 DNA PCR 단편을 사용) 양면 인쇄를 결찰하는 DNA의 구조를 준비합니다. 시작하려면> 1 DNA 밧줄 길이는 μm의, 예를 들면, 여기에 고용으로 ~ 2.7 ㎛의 늘어난 길이에 해당하는 7.9 KBP는, 사용의 용이성을 위해 권장합니다; 특히, 유사하거나 비드 반경보다 짧은 DNA 길이를 사용 인해 MTT 및 FOMT의 부착 형상에 문제가있다. DNA의 길이가 각 도메인에서 시간 응답에 영향을 미치는 방법에 대한 설명에 대한 설명을 참조하십시오. 단일 분자 실험의 흐름 전지를 조립합니다. 플로우 셀의 경우, 이중층 파라 필름 스페이서에 의해 분리 된 두 개의 유리 커버 슬립의 현미경을 사용한다. 최고 현미경 커버 슬립은에 – 유체 셀에 콘센트를위한 두 개의 구멍이 있어야합니다. 그것은 편리합니다구멍을 드릴 분사기를 사용합니다. 바닥 커버 슬립은 니트로 셀룰로오스 (아밀 아세테이트 중 0.1 % 중량 / 부피)로 코팅된다. 하단 슬라이드의 니트로 셀룰로오스 코팅면에 파라 필름 스페이서를 배치하고 깨끗한 상단 슬라이드와 상단을 닫습니다. 유동 세포 봉쇄. 실제 핀셋을 사용하여, ~ 1 분 80 ~ 100 ° C의 설정 히터 플레이트에 조립 된 흐름 셀을 배치합니다. 파라 필름이의 및 콘센트 및 유리 슬라이드가 잘 정렬되어 있는지에 연결 구멍을 봉쇄하지 않는, 흐름 세포가 잘 밀봉되어 있는지주의를 기울이십시오. 참고 : 좋은 물개를 보장하기 위해, 그것은 큰 면봉을 사용하여 스트로크 중 파라 필름에 거품을 추천합니다. 플로우 셀은 자기 핀셋 악기에 장착 될 수있다. 버퍼를 준비합니다. 테 더링 TE 완충액 (10 mM 트리스 – 염산, pH가 8.0, 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 및 200 mM의 염화나트륨)을 준비한다. 또한, 하나는 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 인산염 완충액, pH를 7.4) 승 보충 PBS 버퍼를 사용할 수 있습니다i 번째 100 ㎍ / ㎖의 BSA, 테 더링 버퍼로서 0.1 % 트윈 5 ㎜의 아 지드 화 나트륨 (PBS +). 흐름 세포에 방류 2 ~ 3 셀 볼륨 TE 테 더링 버퍼. ~ 30 분에 대한 흐름 셀에 0.5 또는 1.5 μm의 반경 비자 라텍스 구슬을 품어. 이들 비드는 하나 (즉, 플로우 셀) 및 대물 샘플 홀더 사이 드리프트의 영향을 최소화 할 수 있도록 자기 핀셋 측정 중에 기준 비즈로 작동 할 것이다. TE 테 더링 버퍼의 2 ~ 3 셀 볼륨 린스로 연결되지 않은 비 자석 구슬을 세척하십시오. 적어도 1 시간 동안 PBS에 100 ㎍ / ㎖의 항 – 디곡시 제닌과 인큐베이션 플로우 셀의 바닥 표면을 기능화 (바람직 이상; 항온 배양을 밤새 수행 될 수있다), DNA 부착을 제공하기 위해. TE 테 더링 버퍼의 2 ~ 3 셀 볼륨 린스. 마지막으로, 표면 보호를위한 30 분 동안 TE 테 더링 버퍼에 2 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)과 플로우 셀을 배양한다. 분취을2 ㎖ 스트렙 타비 딘 코팅 된 상자성 MyOne 비즈 (재료의 토론 및 표 참조) 10 ㎖ TE 테 더링 버퍼로 희석. 10 ㎖의 TE 테 더링 버퍼에 자기 입자 농축기, 그리고에 resuspend를 사용하여 10 ㎖의 TE 테 더링 버퍼로 두 번 씻으십시오. 30 분 동안 TE 테 더링 버퍼의 배양이 구슬에 DNA 분자 (약 1 NG)의 ~ 1 ㎖를 연결합니다. 90 ㎖의 TE 테 더링 버퍼를 첨가하여 DNA-닿는 상자성 비드 10 배의 용액을 희석. 마지막으로, 플로우 셀에 용액을 주입하고 항 디곡 시게 닌 – 코팅 된 표면에 DNA 부착을 허용하도록 ~ 1 시간 동안 배양한다. TE 테 더링 버퍼로 완전히 흐름 세포를 씻으십시오. DNA-밧줄 구조의 배양 후, 모든 연결되지 않은 구슬을 제거하기 위해 (이것은 TE 테 더링 버퍼 할 수 있습니다) 실험 버퍼로 광범위하게 세척하십시오. 자석 구슬에 부착 기준 마커 구슬을 필요로하는 각 추적 프로토콜을 사용하는 측정 용 <sup> 23 (토론 참조), 적어도 30 분 동안 TE 테 더링 버퍼에 마커 구슬의 1000 배 희석 주식으로 유동 세포를 배양하고 철저하게 버퍼 씻어. 종래의 자기 족집게에서 하나의 DNA 분자에 2. 측정 흐름 셀의 회전 제약 DNA 분자를 검색, 기존의 MT (토론 참조) 해당 필드의 구성 (그림 1a)와 번역 및 자석 위치의 회전 제어를 모두 사용. ≥ 1 PN의 힘을 당기는에서 (자기 핀셋에 힘 교정에 관한 참고 4, 19, 20, 28, 29 참조), 속박 된 구슬 쉽게 초점이 서로 다른 높이로 바닥 슬라이드의 표면에 붙어있는 구슬을 구별 할 수 있습니다 . DNA 분자는 회전 구속되는지 여부 20-30 차례로 도입함으로써 평가할 수있다≈ 0.25 PN의 힘의 자석들 : 여기에, 밧줄의 길이는 0.4 ~ 0.5 μm의에 의해 감소한다. 주의 : 자성 핀셋 실험을 실행하기 위해, 화상 처리는 DNA-닿는 비즈의 x, y 및 z의 위치를 결정하는데 사용된다. 이 목적을 위해 사용자 정의 LabVIEW 소프트웨어는 요청시 저자에서 사용할 수 있습니다. 비드가 하나의 DNA 밧줄로 연결되어 있는지 확인합니다. 이> 1 PN (그림 2a)의 힘에 긍정적이고 부정적인 회전에서 동작을 비교하여 수행 할 수 있습니다. 단 하나의 DNA의 사슬이 비대칭 응답에 상승을 줄 것이다 반면이 힘 정권에서 여러 유전자의 사슬의 존재는 긍정적이고 부정적인 교대 도입시 확장에 약 대칭 감소로 상승을 줄 것이다. 적절한 수정 구슬에 대한 검색 기준 구슬 역할을 할 수 있습니다 관심있는 밧줄의 주변에 바닥면에 붙어. T의 길이를 조정그는 DNA, 난. flowcell 표면의 위치는 (0.2 PN 아래에서 힘 ~ 60 회전에 의해 상기 자석을 회전시킴으로써, 예) 표면과 접촉 닿는 비드를 가져하여 결정될 수있다. 이 표면에 대한 닿는 구슬의 수직 위치의 측정은 L의 절대 값을보고합니다. 참고 : 드리프트의 후속 효과를 최소화하기 위해서는 표면에 부착 참조 비드의 위치 L 상대적인 측정을 수행하도록 권고된다. 회전 곡선 ≈ 0.25 PN (도 2a)의 신축력에 (회전 수의 함수로서 DNA 연장 즉 측정)을 기록한다. 이것은 DNA 분자가 비틀림 완화되는 상태에 해당으로 확장, 최대되는 회전 수를 결정한다. 이렇게하기 위해서는 positi의 중심을 결정하는 포물선 또는 가우시안 함수로 로컬 회전 곡선 맞추기 위해 유용에. "제로 회전"이 시점을 정의합니다. 참고 :이 목적을 위해 사용자가 작성한 루틴이 요청시 저자에서 사용할 수 있습니다. ~ 20 자석 위치의 일련의, (, "제로 회전"에서, 즉 단계 2.4.1 참조) 비틀림 이완 분자의 평균 연장을 결정하는 Z-추적에서. 단계 2.5의 각 측정 포인트에 대한 정밀 X 또는 Y 위치 20, 28, 29에서 변동 신축력을 결정하거나, 비드의 자화는 로컬 필드 구배 4의 기술을 사용하여, 잘 알려진 제공. 힘 – 신장 곡선의 평균 확장 결과에 비해 인장력 플롯 (그림 2B). Bouchiat 등 (30)에 의해 다항식 근사를 사용하여 웜과 같은 체인 식으로 생성 된 힘 – 확장 데이터를 맞 춥니 다. </lI> 이후 FOMT 측정을 준비하는 경우 (X, Y)에있는 자기 비드의 여행을 기록하는 동안, 천천히 자석을 회전합니다. 주 : MT 종래 구성에서 얻어진 환형의 반경보다 작고보다 밀접 DNA 분자가 더 가까운 자성 비드의 "극"닿는된다. 하나 FOMT 구성으로 전환 할 때, 이러한 DNA 분자는 (x, y) 위치 (설명 참조)에서 회전 각도의 안정적인 트래킹을 가능 자성 비드의 "적도"밀접 닿는한다. 자유롭게 궤도 자기 핀셋을 사용하여 DNA의 트위스트 3. 측정 수동 FOMT (그림 1b)에 사용되는 원통형 자석에 의해 종래의 자기 핀셋의 제곱 자석을 대체합니다. 이 작업은 선택된 DNA 테더가 시야 내에 남아있는 방식으로 수행되어야한다. <ol> 이것은 단순히 종래의 핀셋 구성의 마그넷 보유 완전한 자석 헤드를 풀고 FOMT위한 원통 자석을 보유 자석 헤드로 교체함으로써 1 분 미만으로 달성 될 수있다. 단일 dsDNA 테더에 의해 속박 자기 비드 (x, y)의 편위 원통형 자석 (도 1B,도 3a)의 축에 대하여 테더의 위치에 강하게 의존한다. 특성 변동 패턴 내의 대응하는 위치 (도 3a를 결정하기 위하여 (x, y) 유람를 기록한 토론). FOMT에있는 자석의 거친 정렬을 수행합니다. 이는 (x, y)는 변환 단계를 이용하여 유동 세포 상기 원통 자석을 이동시킴으로써 달성 될 수있다. (X, Y) 여행은 호를 수행하면, 원통형 자석이 올바르게 정렬 및 이동 될 필요가 없습니다적절한 방향 (그림 3B). 거친 정렬은 7.9 KBP의 테더와 MyOne 비즈의 경우에 15 분 이내에 수행하고있다 할 수있다 완료하면 원 운동 (그림 3b, 센터)의 관찰에서 (X, Y) 여행 결과의 측정. 참고 : 거친 정렬은 21, 31 (대표 결과, 그림 5), 사실에도 불구하고 첨부 된 두 차원 히스토그램의 계산이 없을 수 있습니다 FOMT 구성에 닿는 하나의 DNA에 결합하는 단백질에 의해 야기 트위스트의 변화를 관찰하기 위해 일반적으로 충분하다 절대적으로 균일하게 원형 고리 (그림 3C)을 따라 분포. 추가 실험을 위해 필요한 경우, FOMT에서 잘 정렬을 수행합니다. 이 센트 자석 또는 플로우 셀을 이동하거나 고해상도 마이크로 미터 나사 또는 고해상도 자동화 단계를 이용하여 달성 될 수있다어 ~ 10 ㎛ 이내의 구슬 위에 원통형 자석. 정밀한 정렬 단계에서, 자석은 신중 원 환형의 변동으로 인해 자석의 전체 회전에 에너지 장벽이 k 개의 B의 T (도 4) 인 상황에 대응하는, 거의 균일하도록 위치된다. 참고 : 그림 4에서와 같이 히스토그램이나 열상의 변동을 플로팅 MATLAB 스크립트는 요청시 저자에서 사용할 수 있습니다. 참고 : 미세 조정은 7.9 KBP의 테더와 MyOne 비즈의 경우 45 분 이내에 수행 할 수 있습니다, 작은 구슬과 짧은 테더에 대한 감소 시간대에 (토론 참조) 사용된다. 참고 : 미세 조정은 일반적으로 벌거 벗은 또는 단백질 코팅 DNA의 비틀림 강성의 측정 (대표 결과 그림 4)을 수행하는 데 필요합니다. 분석에 필요한 경우 FOMT에 힘을 교정. 이것은 내가에게 실시 할 수있다비드의 자화를 제공 <R 2> (꺾쇠 괄호가 시간 평균을 나타내는 경우) 첨부 된 비디오에 도시 Lipfert 등 21에 설명 된대로, 또는 비드의 반경 변동을 사용하여 MT 유사 NA 방식은 잘 로컬 필드 그라데이션 (21)의 지식을 사용하여, 알려진. 4. 자기 토크 핀셋을 사용하여 DNA 토크의 측정 수동 원통형 자석 플러스 MTT의 측면 (영구) 자석 (그림 1C)에 의해 FOMT에 사용되는 원통형 자석을 대체합니다. 이 작업은 선택된 DNA 테더가 시야 내에 남아있는 방식으로 수행되어야한다. 이를위한 가장 간단한 방법은 수동으로 1 분 이내에 달성 될 수있는 적절한 위치에 가로 자석을 추가하는 것이다. 더 이상의 구조 조정이 필요하지 않습니다. 참고 : 옆 자석에 대한 대안이 사용하는 것입니다32 전자석. 분석을 위해 필요한 경우에, 로컬 필드 구배 (21)의 지식을 이용하여 비드의 X 또는 Y의 변동을 사용하여, MT 유사한 방식으로 힘을 교정하거나, 비드의 자화를 제공 잘 알려져있다. 기점 기반 추적 프로토콜 (23) 또는 첨부 영상에 도시 된 바와 같이, (x, y) 위치 (설명 참조) 모니터링에 기초하여 각도 추적 프로토콜을 사용하여 타임 θ (t)의 함수로서 각 변동을 추적하기. 전자의 경우, 이후의 화상 처리를위한 시간의 함수로서 비드의 전체 이미지를 기록한다. 후자의 경우,이 단계에서의 비드 (x, y)의 변동을 기록하기에 충분하다. 참고 : 기준점을 기준으로 추적 프로토콜 시간의 함수로 비드의 전체 이미지에서 θ (t)를 결정하기위한 MATLAB 스크립트 것은요청에 따라 저자에서로만 제공. 이 자석 (전형적으로 0.1 Hz에서) 여러 차례 회전 천천히 아르 시간 자취를 기록하는 것도 바람직하다 (x, y) 위치 감시에 근거 각도 추적 프로토콜, 논의에서 설명 된 바와 같이. 이것은 하나의 정확하게 토론의 식 3-5을 사용하여 극 좌표 (θ R)에 직교 좌표 (x, y)로 변환 할 수 있습니다. 참고 : (X, Y) 위치는 요청시 저자에서 제공하는 모니터링을 기준으로 각도 추적 스크립트에 대한 MATLAB 스크립트를. 주 : 측정 시간은 원하는 토크 해상도에 주로 의존한다. 자세한 인수 Lipfert 등 (24)에 제시되어있다. MyOne 구슬과 30 ~ 100 초 동안 측정 8 KBP의 DNA의 테더는 1 ~ PN · 나노 범위의 토크 해상도를 제공하기에 충분해야하십시오. 일의 비틀림 트랩의 강성을 결정각 변동의 전자 분산 사용 (σ 라디안, 2 θ) : K θ = K B 형 T / σ θ 2 (1) 참고 : MTT 달성 전형적인 회전 트랩 강성이 10-1,000 PN · ㎚ / 라드, 종래의 자기 족집게 이하의 범위에 있습니다. 또한, 비드의 z 위치를 기록하고 (참조 또한 2.4-2.7 단계) 밧줄 길이 (L)를 측정 할 수. 회전 N이 바뀌면서 (t)와 L (T) θ를 기록합니다. 주 : MT에 비해 감소 된 MTT의 회전 트랩 강성은 단일 분자 토크의 측정에 적합 렌더링 만 발휘 될 수있는 최대 토크가 감소된다는 것을 의미한다. 이 MTT 빠른 회전으로 인한 높은 드래그 토크를 상쇄 할 수 없습니다 것을 의미한다. 케어 따라서 최대 속도를 초과하지 않도록주의해야합니다 티ypically 0.1 Hz에서 가까운 속도로 회전합니다. N은 사용 후에 점등 핵산 테더에 축적 토크가 결정 Γ = – K θ <θ N – 0 θ> (2) 여기서 <…>의 평균 및 θ 0 및 θ N 제로 회전의 각도 (비틀림 편안한 밧줄에 해당되는 의미, 각각의 CF. 2.3 단계와 N가집니다. 반복 완전히 단일 측정 실행에있는 분자의 토크 응답 (대표 결과, 그림 6)를 결정하기 위해 4.5 및 필요에 따라 4.6 단계를 반복합니다.

Representative Results

MT (그림 1a)에서 대표 결과는 그림 2에 나타내었다. 그림 2a는 F에서 찍은 7.9 KB의 DNA = 0.25, 0.5, 2.0 pn을 회전 연장 곡선을 보여줍니다. 회전 단일 DNA의 응답은 긍정적이거나 부정적 plectonemic supercoils의 형성의 결과로서 감소하는 DNA의 확장으로, 낮은 힘 (0.25 PN)에 대칭한다. 처음에는 회전 제약 DNA 밧줄 (2.1 단계)를 검색 할 때이 응답의 질적 지식이 유용합니다. 밧줄의 추가 검사가이 하나의 DNA 분자로 구성되어 있는지 확인하는 데 필요한 참고 : 여기에, 0.5 PN을 초과하는 힘으로 회전 할 수있는 단일 DNA의 비대칭 반응은 여러 DNA를 (단계 2.1.1)과 구별하는 데 도움이됩니다. 이것이 확인되면, 하나는 자석의 회전 수를 정확하게 결정하기 위해 0.25 PN의 회전에 응답하여 반환되는 단일 DNA I하나는 그림 2 B 유사합니다 힘 연장 곡선을 취 곳, 비틀림 편안한들. 이 측정에, 웜 형상 체인 모델 (실선)에 대한 데이터의 착용감 맞춤형 컨투어 길이 L의 C = 2.71 μM 및 굽힘 지속성의 길이 L = 45 nm의 P를 수득 하였다. dsDNA를 들어, 지속성 길이 적합치는 버퍼 조건 (33)에 따라, 범위 40-55 NM에 놓여 야하고, 맞춤형 컨투어 길이 DNA 구조체에 대해 예상 된 값에 가까운 (전형적으로 10 % 이내)되어야한다는 관계의 DNA L = 0.34 ㎚ / BP · 염기쌍의 개수를 이용하여, 측정에 사용된다. 그림 3은 FOMT의 절차 및 정렬의 결과 (그림 1b)를 보여줍니다. 단계 3.2에 기록 된 초기 (x, y)는 유람 O 함수로서 변동의 전체적인 뷰에 비교 될 수있다F FOMT 개최 마그넷과 DNA-닿는 구슬 간의 후속의 상대 변위를 안내하는 데 사용될 수있는 "와류"패턴을 도시도 3a에 도시 된 횡 자석 위치. 후속 조악한 정렬이 완료되면도도 3b에서 검은 색 트레이스에 의해 도시 된 바와 같이, 비드의 (x, y)의 변동은, 원형 궤적을 추적. 이 시점에서, Z-축 주위에서 자석 토크는 열적 변동의 부착 점을 중심으로 비드를 회전 충분 있다는 점으로 감소된다. 그 결과 원형 고리 (장착 원이 빨간색으로 표시됩니다)의 반경 R의 원은 DNA의 연결 지점 및 비드의 중심 (그림 1b) 사이의 반경 거리를 나타냅니다. 도 3c에 도시 된 바와 같이, 그러나,도 3b에 데이터의 히스토그램 엉성한 맞춤 균일 커버리지를 보장하지 않는다는 것을 보여준다원형 고리를 따라 모든 가능한 위치. 열적 변동 원의 모든 회전 각을 탐구하기에 충분하다하더라도, 자유 회전로 (열에너지 K 개의 B의 T의 순서의) 작은 에너지 장벽이 남아있다. 미세한 정렬이 FOMT (3.4 단계)에서 수행 될 때, 기기는 DNA의 비틀림 계수 (도 4)를 결정하는데 사용될 수있다. 첫째, 샘플의 미세 조정은 그 두 가지 차원 히스토그램 지금 (그림 4B) 균일 한 범위를 표시해야합니다 원 운동 (그림 4a)를 얻는 데 사용됩니다. ((X, Y) 위치의 변환에 의한, 아래 참조) 각 변동의 대응 시간 추적 Q (t)는 주기성이 360 ˚ (도 4c)에 해당되지 표시하고 여러 전체 회전에 대응하는 큰 여행 (그림을 보여 4D). 내재 에너지 풍경> 1000 ˚ (그림 4E)의 범위에서 조화입니다. 변동의 표준 편차는 K의 각 트랩 강성에 대응, σ θ = 223 °입니다 θ = K의 B T / σ θ 2 = 0.27 PN · 차례로 유효 비틀림 지속성 길이의 추정치를 제공 ㎚ / 라드, 측정 된 힘의 C = L의 C / σ θ 2 ~ 76 나노 미터 (이 측정에 사용되는 3.4 KBP의 DNA에 대한 L의 C = 1,150 nm의)에 해당 DNA의. FOMT는 단백질 (31)의 결합을 통해 속박 DNA 분자로 유도 된 비틀림의 변화를 측정하는 데 사용될 수있는 방법의 예는, (34)은도 5에 도시된다. 여기서, 우리는 두 배로 RAD51 단백질의 결합을 관찰했다좌초 된 DNA를; RAD51은 길게 모두 알고하고 핵 단백질의 필라멘트 (31)를 형성하는 등 DNA를 긴장된다. 흐름 세포에 RAD51 플러싱에, 우리는 비드가 FOMT (그림 5a)의 나선형 궤도를 거쳐 관찰. 상술 한 바와 같이 Q (t)에 대한 시간의 함수로 (X, Y)의 움직임 추적을 변환함으로써, 우리는 RAD51는 DNA 밧줄의 길이와 긴장을 풀기의 그것의 정도에 어떤 영향을 플롯에게 협력 할 수 있습니다 (그림 5b, C) . DNA의 비틀림 특성을 측정하는 또 다른 방법은 MTT (그림 1C, 그림 6)이다. 그림 6a의 개략적 인 측정의 원리를 보여줍니다 overwinding 후 (또는 underwinding) N에 의해 DNA 밧줄이 회전, DNA가 θ N 0 θ의 평형 각 위치의 변화로 연결 비드에 복원 토크를 발휘한다. MTT에서 자기장의 가로 구성 요소는 여전히 비드 회전 (그림 1)을 허용하면서 이러한 각도 변화의 측정을 용이하게 MT에 비해 감소된다. N = 45을 적용한 후 측정 된 각도 변화의 크기는 7.9 KBP의 DNA에 회전은 그림 6b에 나와 있습니다. MTT 측정 프로토콜과 DNA의 회전 곡선 대 토크의 결과 결과의 전체 시퀀스도 6c-F에 표시됩니다. 여기서, 좌표 각도의 표준 편차 (도 6c) 및 평균치 (도 6D)의 측정은 표준 편차가 각 트랩 강성 (수학 식 1)에 반비례 채로, 오버 및 underwinding의 함수로서 도시된다. 이와 함께,이 수량을 중심으로 한 선형 응답 영역을 표시해야합니다 DNA의 회전 곡선 (그림 6 층), 대 토크를 구성 할 수 있도록 약 0집니다ND 개의 고원되는 양극과 음극 회전에서 토크 포화, 각각. 회전 곡선에 비해 이러한 토크함으로써 DNA의 좌굴 및 변성을 동반 전환을 정량화, 회전 곡선 (그림 6E) 대 확장의 정보를 보완합니다. 그림 1. 종래의 자기 핀셋의 회로도 (MT), 자유롭게 선회 자기 핀셋 (FOMT), 자기 토크 핀셋 (MTT), 및 회전 각도를 추적하기위한 두 가지 전략. (a) 자기 핀셋의 세 가지 구현 예에서, 자성 비드가 작용하여 고분자 유동 세포 표면에 닿는되어, 예를 들어 이중 가닥 DNA 분자는 개략적으로 도시. 참고 비즈는 흐름 세포 표면에 부착 drif에 대한 추적T 보정. 세 MT 셋업 따라서, DNA 밧줄을 자기 비드에 위쪽으로 스트레칭 힘을 적용하는 자석을 사용합니다. 종래의 MT에서, 한 쌍의 자석 군과 DNA-테더 축 주위 비드의 주위를 구속, 횡 테더 축에 상대적으로 배향 자계를가한다. FOMT에서, 원통형 자석 테더 방향으로 배향 자계를 제공한다. 테더는 원통형 자석의 중심에 정렬되면, 나머지 횡 필드 MTT 있음 테더 축을 자유로운 회전을 허용하는, 최소화, 측 자석 제공하기 위해 FOMT에서 사용되는 원통형 자석에 첨가 (MT에 비해 크기 감소) 작은 가로 필드. 이 작은 횡 필드는 토크의 응용뿐만 아니라 측정을 가능하게한다. (b) DNA-테더 축을 자성 비드의 회전 각도를 측정하기 위해 두 가지 전략을 나타낸다. 1) : 마커 비드 (GREEN) 자기 비드 (갈색)에 부착하여 분석을 상상 추적 각도를 가능하게하는 비대칭 이미지를 제공합니다. 0.5 μm의 반경 기준 마커와 1.4 μm의 반경 자기 비드의 두 개의 CCD 이미지는 초점과 초점이 맞지 않는, 표시됩니다. 2) DNA가 얻어 비드 남 극에서의 위치에 자성 비드에 닿는 경우에는, 비드의 중심은 그 중심 각도 위치를 정의하는 원호를 따라 변동한다. 테더는 비틀림에 따라서 단일 분자 토크의 측정을 가능하게 (오른쪽 트레이스) 변형 될 때 하나의 전략은 회전 각도를 추적하고, 각 위치의 변화를 모니터링하는데 사용될 수있다. 기존의 MT 그림 2. DNA 교정 측정. F = 0에서 찍은 7.9 KB의 DNA에 대한 () 회전 – 신장 곡선0.25, 0.5, 2.0 PN. 단일, 이중 가닥 DNA의 테더의 긍정적이고 부정적인 회전에 회전에서 비대칭 반응은 밧줄 첨부의 편리한 테스트로 사용할 수 있습니다. 함께에 맞는 디자인, 7.9 킬로바이트의 DNA에 대한 (B) 힘 – 신장 곡선, 벌레 장착 윤곽 길이 L의 C를 산출 체인 모델 (실선), 등 = 2.71 μm의 굽힘 지속성 길이 L의 P = 45 나노. 모든 측정은 PBS 버퍼에 수행되었다. FOMT 그림 3. 정렬. (a) (x, y)의 마그넷 위치의 함수로서 FOMT 개최 DNA-닿는 비드의 변동. 원통 자석의 위치는 X 250 μM 씩 유동 세포 표면에 걸쳐 3mm의 일정한 높이에서 스캔 하였다 <em> Y와는 외부 플롯 축에 표시되어 있습니다. 각 자석 (X, Y) 위치에서, 같은 DNA-닿는 구슬의 변동을 기록하고, 작은 좌표계 (오른쪽 하단에 눈금 막대가 모든 하위 좌표 시스템에 적용)으로 꾸몄다. 비드의 (X, Y) 자석의 위치가 사이클론 또는 소용돌이 닮은 – 변동 패턴의 체계적인 변화는 분명하다. 이 "선회"패턴 정렬을 달성하기 위해 x 및 y (큰 화살표로 표시)에 (고정 자석을 유지하면서 또는 대안 테더) 자석의 변위를 안내하기 위해 사용될 수있다. 조악한 정렬이 완료되면 비드의 (x, y)의 변동은 원형 궤적 (플롯의 중심에 푸른 트레이스) 체크 추적. 이 추적은 중심을 작은 단계로 자석을 정렬하고이 플롯의 그림에 표시 한 후 별도의 실험에서 기록되었다. t에서 개최 DNA-닿는 비드 (B) (X, Y) – 변동그는 자석 (블랙 추적)를 성공적으로 거친 정렬 후 FOMT. 변동은 원형 고리에 놓여 및 열 변동 원에 각도 모든 회전을 탐험하기에 충분하다. 장착 원이 빨간색으로 표시됩니다. (C) 히스토그램은 거친 정렬이 순환 고리를 따라 모든 가능한 위치의 균일 한 커버리지를 보장하지 않는다는 것을 보여주는, (B)의 데이터에 대응. 열적 변동 원의 모든 회전 각을 탐구하기에 충분하다하더라도, 자유 회전 (열적 에너지 k 개의 T의 B의 순서)에 에너지 장벽이 남아있다. 그림 4. FOMT를 사용하여 DNA 비틀림 강성의 측정. (X, Y) – 궤적 (A) 및 히스토그램 (B)의 DNA-테트라FOMT의 상대적인 자석 밧줄 위치의 미세 조정 한 후 비드의 변동을 ered. 이러한 상황에서, 히스토그램은 원의 위치를 본질적으로 균일 한 범위를 알 수있다. (X, Y) 위치. (D)의 회전 변동의 히스토그램에서 결정 구슬 (다) 회전 수의 변동이 있습니다. 빨간색 선은 σ θ = 223 ° 가우스 적합합니다. (E)의 회전 변동 (C)의 농도 및 (d)에 의해 암시 에너지 풍경. 회전 변동에 의해 암시 에너지 풍경 및 (K θ = K의 B T / σ θ 2 = 0.27 pN-nm/rad)와 조화 근사치의 차이는 여러 차례에 걸쳐 열 에너지 케이 B의 T보다 훨씬 작다. 데이터는 이러한 명확성을 위해 오프셋이 0 = 0 θ. 폭변동은, DNA의 비틀림 강성을 결정하는 본문을 볼 수 있습니다. 측정은 1 ~ PN의 신축력에 PBS 완충액에서 수행 하였다. 데이터는 Lipfert 등 21에서 적응됩니다. 도 5. DNA에 RAD51 단백질의 결합은 FOMT를 사용하여 측정. () 속박 7.9 KBP dsDNA 상 RAD51 단백질의 조립 3.5 PN에서 모니터. (X, Y, Z) 어셈블리의 처음 200 초 동안 자기 비드 (직경 1.0 mm)에 의해 실행 – 궤도는 시간이 파란색에서 빨간색으로 색상 코드와 함께 표시됩니다. (b)는 dsDNA의 확장 추론 추론 dsDNA 테더 축을 중심 (a)는 시간의 함수로서. (c) 회전 각도에서 비드 궤적의 z 성분으로부터X에서, 시간의 함수로서 (a)에서 비드 궤적의 Y 구성 요소. MTT의 단일 DNA 밧줄 그림 6. 토크 측정. (A) 도식은 토크 측정의 원리를 보여주는. (언더 오버 나) N에 의해 DNA 밧줄이 회전 권선 후, DNA는 θ의 N 0 θ의 평형 각 위치의 변화로 연결 비드에 복원 토크를 발휘한다. 사용되는 각 트레이스의 (b)의 예 토크를 측정하는 방법 :. 성에서 개최 PBS 버퍼에 7.9 KBP의 DNA 분자 (파란색) 전에 40 차례 (진한 빨강)를 도입 한 후 비틀림 편안한 7.9 KBP의 DNA 분자에 닿는 구슬의 각도 변동 (CF) 토크 측정기준 마커 구슬을 기준으로 각도 추적 프로토콜을 사용하여 2 ~ 3 PN의 힘을 구역질. 각도 변동 (b) 적용 권수의 함수로서 기록 하였다. (c)의 각도 변동의 표준 편차를 적용 회전의 함수로서 도시 된 바와 같이. 변동의 폭은 등각 트랩 강성을 나타내는 대략 일정하다. (d)인가 회전의 함수로서 평균 회전 각도의 변화. 이상과 underwinding시 평균 각도의 체계적인 변화는 명백하다. (e)인가 회전의 함수로서 동시에 모니터링 DNA 테더 확장자. (f) (d)에 나타낸 평균 각도로부터 결정된 DNA 테더에 의해 가해지는 토크 메인 텍스트를 참조하십시오. 오버 제로 도는 underwinding 것은 선형 토크 대를 일으킨다는 (~ 7 효과적인 비틀림 지속성 길이를 결정하기 위하여 사용될 수있다 DNA-테더 (장착 그레이 슬로프 이온 (d) 및 (f))의 반응을 점등이 데이터 세트에 대한 7 NM). 또한 좌굴과 (개략적 인 세트 참조) plectonemic supercoils의 형성 (~ 26 PN · nm에서 (F)에 긍정적 인 회전에 검은 선) 토크 고원 및 번호와 함께 밧줄 확장의 선형 감소에 대응하는 리드를 overwinding 회전의 () E (블랙 경사). 선형 정권을 넘어 풀기는 ((F)에서 ~ -11 PN · 뉴 멕시코에있는 음의 회전에 검은 색 선) 용융 토크에 해당하는 토크 고원의 표시, (왼쪽 인 세트 참조) 로컬 녹아 DNA가 발생합니다.

Discussion

MTT 또는 FOMT를 사용하여 실험을 실행하는 경우, 선택의 수 등 구슬, 자석, 추적 프로토콜을 할 수있는 가장 좋은 선택이 관심의 실험에 따라 달라집니다에 대해 할 필요가있다. 다음, 우리는 특정 실험에 대한 선택을 용이하게해야하는, 다른 선택을 동반 절충을 설명합니다. 다음으로, 우리는 MTT 및 FOMT 실험의 정렬 및 실행 함께 몇 가지 중요한 단계를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 기존의 방법에 대해서뿐만 아니라 미래의 응용 프로그램과 MTT 및 FOMT의 중요성을 토론한다.

이전 MTT 및 FOMT 실험의 시작에 대한 고려 사항

모든 실험은 사용을위한 자기 구슬의 종류를 선택하기 위해 하나가 필요합니다. 하나는 여러 가지 시판 스트렙 타비 딘 – 코팅 된 상자성 구슬, 예를 들면, 0.25 μm의 반경 구슬, 0.5 μm의 반경 구슬, 또는 1.4 ㎛의 반경 비즈 (들 사이에서 선택할 수 있습니다) 자료 표를 EE. 큰 구슬 (약 볼륨으로 확장) 작은 구슬에 비해 증가 된 자기 모멘트를 갖게되며, 따라서 자신의 사용은 더 높은 힘의 응용 프로그램을 촉진 할 것이다 (우리의 악기에 달성 전형적인 부대를, 표 1 참조). 마커 구슬을 사용하여 각 추적이 요구 될 때, 우리는 일반적으로 1.4 μm의 반경 일을하고 (해당 첨부 파일 프로토콜에 대한 단락 1.9 참조) 마커 구슬로 0.5 μm의 반경 비자 바이오틴 구슬을 사용합니다. 작은 구슬의 사용은 특히 구슬 회전 τ의 특성 척도로 _C는 스프링 정수 γ / K _(θ)을 통해 시스템의 드래그의 비율을 동일, FOMT 추천합니다; 중요한 것은, ~ R _구슬 ^3, 즉 반경의 세 번째 파워와 각도 측정 시간의 척도 저울과 관련된 회전 저항 계수는 (표 2 참조특성 시간은 몇 FOMT 비드-DNA 조합 및 MTT 측정)에 대한 확장. 적용 할 수있는 최대 힘의 감소는 첨부 된 원통 자석 ^(27)의 대칭 스택을 사용하여 해결 될 수있다. 그럼에도 불구하고, FOMT 측정에 때로는 최고의 성취 할 수있는 시간 해상도 및 최대 적용 힘 사이에서 타협 할 필요가있다.

또한, 실험은 자석 구성의 선택이 필요합니다. 종래의 자기 핀셋 구성 (그림 1a)에서, 우리는 일반적으로 자석 ^(4)의 0.5 1mm 간격으로 수직 방향으로 5x5x5 mm 입방 자석의 쌍을 사용합니다. 자석을 X (Y) 축 방향으로 이격 될 때, 이것은 주로 X (Y) 축 방향으로 지향 자계를 산출한다. FOMT 실험의 경우, 원통형 자석을 그 중심 자기장이 주로 지향에서 선택된Z 축 방향 (도 1B). 실제로, 우리는 6mm의 총 두께에 대해, 예컨대 세 개의 원통형 자석, 6mm의 직경 2mm 직경의 중앙 구멍이 각각의 스택을 사용한다. 높은 당기는 힘이 요구되는 경우, 아래쪽 자석이 대향 자화로 적층 된 "대칭 스택"마그넷 구성이 바람직하다. MTT 구성 (도 1C)을 달성하기 위해, 우리는 FOMT 구성, 4mm 직경 7 ㎜의 높이가 일반적으로 고체 실린더의 메인 마그네트 스택의 측면에 추가 자석을 추가한다. 우리의 악기 달성의 최대 힘은 자석 구성에 따라 방법 (표 1 참조)를 참조하십시오.

MTT 및 FOMT 실험의 정렬

자기 비즈 (약) 균일하게 작용면을 가지고 있기 때문에 (일반적으로 스트렙 타비 딘) 및 기능화 N 양의 부착 이후ucleic 산의 사슬 마커 비즈 (경우에 마커 비드 기반의 각도 추적이 사용된다) 밧줄 및 / 또는 마커 구슬 자석 구슬에 부착 곳 솔루션의 간단한 배양을 통해, 하나는 제어하지 않습니다 발생합니다. 자성 비드는 외부 필드의 방향으로 정렬하는 경향이 바람직한 자화 축을있다. 우리가 선호하는 자화 축이 북극과 남극으로 구슬의 표면을 교차하는 지점을 나타내는 경우, DNA-밧줄이 가까운 적도에 연결된 구슬에 가까운 또는 약간보다 큰 반경을 가진 원형의 고리를 추적 할 것이다 FOMT 비드 반경; 대조적으로, 남극 부근에 부착 된 구슬은 식 3-5을 사용하여 원의 피팅을 배제 할 수있는 FOMT 매우 작은 반경의 원형 고리에 변동됩니다. 우리는 단순한 구면 형상으로, 적도 근처에 부착하는 확률이 정확히 극의 첨부 파일보다 훨씬 큰 있습니다; 따라서 대부분의 BEADS가 닿는 것 (x, y)를 기반 각도 추적 성공적 수행 될 수 있도록.

비슷한 인수는 기준 마커를 기반으로 각 추적을위한 마커 구슬의 부착을 위해 보유하고 있습니다. 마커 비드 각도 추적을 가능하게하는 자기 비드의 이미지에서 비대칭을 만드는 데 사용됩니다. 마커 비드는 비드 (즉, 직접 상단 또는 하단)의 북쪽 또는 남쪽으로 극에 정확하게 연결되어있는 경우, 결과 이미지는 여전히 회전 대칭이며, 각 추적 프로토콜이 실패합니다. 그러나 같은 구면 기하학 인수로, 마커 구슬 기둥 중 하나에 직접 연결하는 기회가 상대적으로 작다; 우리는 실제로 대부분의 마커 비즈 각도 추적을 가능하게하는 충분한 비대칭을주는 것을 발견했습니다. 마지막으로, 종래의 자성 핀셋에 전계 방향 (x, y) 평면에 있음을주지; 따라서, 비드의 바람직한 자화 축은 회에 맞출 것이다E (X, Y) 평면과 북극과 남극, 상기 정의 된 바와 같이, 비드의 측면에있을 가능성이 기둥의 상단과 하단에있는 FOMT 또는 MTT있는 상황. 예정

FOMT 실험에서 중요한 단계는 방사상 자기 필드가 비드에 근접 무시할되도록 원통 자석의 배향이다. 이 정렬은 한번에 단일 비드에 대해 수행된다. FOMT 비드 움직임이 균일하게 순환 고리에 분산되어 있는지 여부를 판단하기 위해, 측정 시간은 20 · τ의 _C를 초과해야한다. τ의 _{C 8} KBP의 DNA 및 0.5 mm 반경 비드 ~ 45 초에 해당 바와 같이, 측정 시간은 배향의 최종 단계에서 ~ 900 초이다. 1.9 KBP의 DNA를 비교, 사용 및 0.25 mm 반경 비즈 τ의 _C 스물 배에 1 ~ 2 초 (또한 표 2 참조)이 줄어 듭니다.

F 동안 추적을위한 중요한 단계 및 고려 사항OMT와 MTT 실험

비드의보기 면내 변동을 추적하기 위해, 그것의 (x, y)의 위치, 즉, 우리는 이후의 시간 간격 ^{(35, 36)에서} 비드에 의해 표시 강도 프로파일의 교차 – 상관 분석을 이용한다. 이것은 몇 나노 미터 ^(20)의 정확성에 서브 픽셀 해상도로 수행 될 수있다. Z에서 구슬의 움직임을 추적하기 위해, 우리는 일반적으로, 핵산 ^(20)에 부착 비드의 회절 고리를 이미지하면서 대물의 초점면 (OFP)가 정확하게 수직 방향으로 이동되는 제, 고스와 크로켓 의해 설계 방법을 사용 . 이러한 방식으로, 보정 프로필 비드와 OFP ¹⁹ 사이의 거리에 비드의 회절 패턴을 상관 생성된다. 이 교정 프로파일이 보간 될 때, 비드의 수직 변위는 거의 ²⁰ ㎚까지의 정밀도로 측정 할 수있다.우리는 더 세련된 추적 알고리즘 ^{(37, 38)뿐만} 아니라 여러 구슬 ^{5, 6, 37의} 추적을 병행하는 자신의 응용 프로그램을 설명하는 추가 참조에 대한 독자를 참조하십시오.

각 좌표로 (x, y) 위치의 변환에 의존 각도 추적을 사용하는 경우, 우리는 다음과 같이 진행하도록 조언한다. 비드 사용, 원형 고리를 추적하는 시간 추적에서 (X _I, Y, _I) 위치 (어디 이후의 측정 지점을 표시하는 인덱스) 원 중심 (x _0, y를 ₀₎ 및 반경 R _{원에 맞게} 최소화하여 (그림 2A)

(3)

합계는 모든 데이터 포인트를 통해 실행 됨. fitti에 후NG X _{0, 0,} Y 및 R _{동그라미,} 사용 시간 추적에서 각 데이터 포인트의 극좌표 (R _{I, I θ)을} 결정 :

(4)

(5)

한 단계의 ±의 점프 π 적절한을 추가, 즉 각도 θ "를 푸는"을주의해야합니다. (R, θ) 좌표 (x, y)에서 피팅 및 변환 사용자가 작성한 코드는 요청시 저자에서 사용할 수 있습니다. FOMT에서 비드가 원형 고리를 추적 추적하는 시간을 거친 정렬 (참조 단계 3.3)를 달성하고 비드의 열 변동을 기록하여 얻을 수있다. MTT, 열 변동까지의관리 포인트는 원형 고리를 추적하기에 충분하다; 대신, 식 3-5을 사용하여 원을 맞추기 위해 여러 차례 회전 자석 (일반적으로 0.1 Hz에서) 천천히 있습니다 시간 추적을 사용합니다.

우리는 (MTT, 그것은 각도 추적 마커 (그림 1C, 그림 1D, 그림 3a)를 통해 또는 각도 좌표로 (x, y) 위치의 전환을 통해, 즉 적절한 각도 추적 방식을 선택하는 것이 중요합니다 있습니다 그림 1D, 그림 2B). 일반적으로 (x, y)의 위치와 마커 구슬의 사용에서 각 추적의 정확도는 비교할 수 있지만, 그것은에 설명 된대로 크로스 토크 (X, Y) 및 각도 구슬의 변동 사이에 발생 실현하는 것이 중요합니다 얀센 등 알 ³² : 따라서, (x, y) 위치에서 각 추적을 제공하는 경우에만 유효하다 (X에있는 브라운 변동, Y)은 좌표 각도의 불확실성, 그리고 (X, Y) 추적 측면 자석의 위치 조정을 통해 회전 트랩 강성의 조정이 필요할 수의 적절한 사용으로 만 무시할 기여한다. 통상적으로, 높은 강성의 트랩 사용 마커 비즈를 사용한 각도 추적의 사용을 필요로한다. 마커 비드의 사용은 (단계 1.9에서 첨부 프로토콜 참조) 사용할 테더의 수를 감소시킬 추가적인 어태치먼트 단계를 필요로한다. 마커 비드 기반 추적을 사용하는 경우에는 마커 비드 최상의 결과 적도 부근에 부착되어있다 자성 비드를 선택하는 것이 중요하다.

FOMT 및 MTT의 의의는 기존의 방법과 응용 프로그램에 비해 접근 방식

이상에서 우리는 쉽게 MTT 또는 FOMT에 악기를 변환하는 자석 구성을 수정 한, 기존의 MT에서 시작하는 방법을 보여 주었다. 이 간단 modification, 각도 추적 마커의 사용이 요구되는 각도 추적의 도입에 의해 수반 될 수있는, 그것이에 따라 토크를 적용 토크를 측정 또는 비틀림을 측정하도록 사용자에게 허용하는대로, 두 구성의 즉각적인 강한 포인트 손에 실험. 서론에서 언급 한 바와 같이, FOMT 및 병렬 측정 ^5의 기능의 혜택 특히 MTT와, 특히 자신의 단순, MT의 기존 강점의 많은에서 MTT의 혜택을 모두 ⁶ (이가 쉽게 FOMT 달성하지 원통 자석의 중심에 대하여 테더의 배향 요구). 특히, MTT 및 FOMT는 다른 기술, 특히 나노 입자 제조 ^{22, 39, 40,} 복잡한 광학 설계 ^(41), 또는 속박 내에서 추가 비즈의 도입 (DNA) 분자 ^(42)과는 대조적으로, 필요하지 않습니다. 오 이런거기 기술은 그럼에도 불구하고 더 높은 시간 해상도 ^{27, 43, 44} 등의 장점을 제공 할 수있다. DNA의 분자 모터의 동작이 모두에 의해 영향을받으며 지역의 트위스트와 토크에 대한 결과를 가지고 FOMT 및 MTT 모두, 게놈 처리의 연구에서 미래의 응용 프로그램을 찾을 수 있어야합니다. 추가 응용 프로그램이 DNA 나노 기술 ^(27)의 신흥 분야에서 생물학적 처리 ^{7, 45에} 적극적으로 회전하는 모터의 넓은 필드에서 찾을 수 있습니다.

	M270 (R _구슬 = 1.4 μm의)	MyOne (R _구슬 = 0.5 μM)	Ademtech (R _구슬 = 0.25 μM)
기존 MT (입방 5 × 5 × 5 ㎜ ³ 자석 쌍, 1mm 간격, 수직 정렬)	70 PN	8 PN	1.6 PN
FOMT 또는 MTT * (세 개의 원통형 자석의 스택 6 mm 직경 2 mm 직경의 차이)	9 PN	1 PN	0.2 PN
FOMT 또는 MTT * (세 개의 원통형 자석의 스택 6 mm 직경 1 mm 직경의 차이)	18 PN	2 PN	0.4 PN
FOMT 또는 MTT는 * (마지막 세 개의 원통형 자석의 스택을 뒤집어, 직경 1mm 간격)	~ 50 PN	9 PN	1.8 PN

* MTT 날씬한 자석의 존재는 스트레칭 힘에 미치는 영향은 무시할 수있다

표 1. 최대 힘은 일반적으로 서로 다른 자석의 구성과 구슬 유형에 달성했다.

	R _구슬 = 1.4 μm의	R _구슬 = 0.5 μm의	R _구슬 =0.25 μm의
마찰 계수 ^*	120 PN · 뉴 멕시코 · 초	5.5 PN · 뉴 멕시코 · 초	0.7 PN · 뉴 멕시코 · 초
특성 시간 스케일 : FOMT, 10 KBP의 DNA ^**	1200 초	55 초	7 초
특성 시간 스케일 : FOMT, 1 KBP의 DNA	120 초	5.5 초	0.7 초
특성 시간 스케일 : MTT, 케이 _Q = 100 PN · ㎚ / RAD	1.2 초	0.06 초	0.007 초
특성 시간 스케일 : MTT, 케이 _Q = 1000 PN · ㎚ / RAD	0.12 초	0.006 초 = 6 밀리 초	0.0007 S = 0.7 밀리 초

^* "적도"관통 축에 대한 회전 마찰 계수 (도 1b에 도시 된 상황 즉,), (14)에 의해 주어진 · P · H · H가 버퍼의 점도 R _구슬 ^3.
^* FOMT에서 회전 트랩 강성이 DNA의 비틀림 강성, K의 _Q에 의해 _{제공됩니다, DNA} = C는 · C가 유효 비틀림 지속성 길이 K의 _B의 T / L _(C)는,, (여기에 80 나노로 간주 중간 힘 정권, F ~ 1 PN)와 L의 _C의 특징 인 것은 DNA 염기 쌍 당 0.34 나노 미터의 윤곽의 길이입니다.

표 2. 마찰 계수와 특성 시간 FOMT 및 MTT 용 저울.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 TU 델프트, 과학 연구에 대한 네덜란드기구 (NWO), 문제에 대한 기본 연구를위한 기초 및 유럽 과학 재단에 의해 지원되었다.

Materials

Sandblaster	Great Lake Orthodontics	190-070 Microetcher II
Nitrocellulose	Life Technologies	LC2001
Magnetic particle concentrator	Life Technologies	12002D
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius)	Polysciences	17010
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius)	Sanbio	PV05N/2179
Antidigoxigenin	Roche	11 214 667 001
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius)	Ademtech	3150
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”)	Life Technologies	650.01
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”)	Life Technologies	653.05
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius)	Life Technologies	F-8768
Cubic magnets for conventional tweezers	Supermagnete	W-05-N50-G
Cylindrical magnet for MTT and FOMT	Supermagnete	R-06-02-02G
Side magnet for MTT	Supermagnete	S-04-07-N
Linear stage	Physik Instrumente	M-126.PD
Rotary stage	Physik Instrumente	C-150
High-resolution automated sample stage	Physik Instrumente	P-733.2D
Software for coding analysis routines	The Mathworks	Matlab	custom-written routines are available from the authors

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Cite This Article

Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).

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