磁性镊子的扭曲和扭矩的测量

1制备的DNA样品和孵化准备被连接到双工端（通常采用≈600 bp的DNA PCR片段），这些功能化的多生物素和地高辛组，分别为18 DNA结构。开始，一个DNA系绳长度> 1微米， 例如 ，一个7.9千碱基对应〜2.7微米的拉伸长度为这里采用，被推荐用于易用性;特别是，利用DNA长度是类似于或高于所述胎圈半径短是有问题的，由于在MTT和名华附件几何形状。请参阅讨论有关如何DNA的长度会影响响应时间在角域的描述。 装配流动池对单分子实验。为流动池，可以使用两片玻璃显微镜盖玻片由双层封口膜垫片隔开。顶显微镜的盖玻片应该有两个孔流体入口和出口的单元格。可以很方便地用喷砂来钻孔。底部的盖玻片上涂有硝酸纤维素（0.1％重量/体积的乙酸异戊酯）。将封口膜垫片底部幻灯片的硝化棉包覆侧，用干净的玻片顶部关闭顶部。 密封所述流动池。使用物理镊子，将组装的流动细胞上的加热板设定为80〜100℃下进行约1分钟。注意流通池密封良好，该封口膜不会关闭关闭该连接在和插座，且玻片完全一致的孔。 注：为了确保良好的密封，它是用一个大的棉签推荐行程出的封口膜气泡。流动池可以被安装在磁镊子仪器。 准备缓冲区。准备TE圈养缓冲液（10mM的Tris-HCl，pH值8.0，1mM的乙二胺四乙酸（EDTA）和200 mM氯化钠）。可替换地，可以使用PBS缓冲液（137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10mM磷酸缓冲液，pH 7.4），补充瓦特第i个100微克/毫升BSA，0.1％吐温和5mM叠氮化钠（PBS +）作为束缚缓冲区。冲洗2-3细胞体积的TE缓冲液圈养进入流通池。 孵育0.5或1.5微米的半径的非磁性的乳胶珠中为〜30分钟的流动池。这些珠将在磁镊子测量，允许一个最小化漂移的目的和样品架（ 即流动池）之间的效果作为参考珠。通过用TE缓冲液圈养2-3细胞体积冲洗冲洗出独立的非磁性珠。 通过温育与100μg/ ml的抗洋地黄毒苷的​​PBS中为至少1小时官能流动池的底表面（优选更长;孵育可过夜进行），以提供用于DNA附着。冲洗用的TE缓冲液圈养2-3细胞体积。最后孵育流动池用2毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）的TE缓冲圈养30分钟进行表面钝化。 采取的等分试样2毫升链亲和素包被的超顺铭扬珠（见讨论材料和表），并稀释用10ml TE缓冲液圈养。使用磁粉集中，重悬在10毫升的TE缓冲液圈养用10ml TE缓冲液圈养洗两次。附上约1毫升的DNA分子（约1毫微克）的这些珠孵育于TE缓冲圈养30分钟。 通过添加90毫升TE缓冲圈养稀释的DNA拴超顺磁珠10倍的溶液。最后，将溶液注入流动池并孵育约1小时，以允许DNA附着到抗地高辛包被的表面上。用TE缓冲液圈养彻底清洗流通池。该DNA连接臂构建体的温育后，用实验缓冲液冲洗广泛（这可以是TE圈养缓冲器），以除去所有非附着珠。 用于测量雇用的角跟踪协议，它需要附着在磁珠上基准标记珠<sup> 23（见讨论），培育流通池用的TE缓冲液圈养珠标记1000倍稀释股票至少30分钟，冲洗彻底的缓冲区。 2，在常规的磁性镊子对单个DNA分子的测量使用传统的MT（见讨论）与相应字段的配置（ 图1a）和两个平移和磁铁位置的旋转控制，搜索在流通池中旋转受限的DNA分子。在拉动≥1 PN力量（参考文献4，19，20，28，29关于力校准磁镊子），拴珠可以很容易地从珠中的焦点粘在底部滑动表面由他们不同的高度区分。是否一个DNA分子被旋转约束可以通过引入20-30轮流进行评估磁铁在≈0.25 PN的力S：在这里，系绳长度应为0.4-0.5微米的下降。 注意：要运行磁镊子实验中，图象处理被用于确定在x，y和z的DNA -拴系的珠子的位置。自定义的LabVIEW软件，为此可从应要求作者。 验证珠子连接由一个单一的DNA系绳。这可以通过在正极和负极匝数为> 1的PN（ 图2a）的力量比较的行为来完成。在这股力量的制度，多个系绳的DNA的存在将导致在引入后，正面和负面的转弯延伸约对称的减少，而单个DNA系绳将产生一个非对称的回应。 搜索相应的固定孔玻璃珠粘在底表面在感兴趣的系绳，可以作为参考珠的附近。 校准T的长度他的DNA，L。流动池表面的位置可以通过将接触系留珠与表面来确定（ 例如 ，由60〜轮流低于0.2 PN力旋转磁铁）。的系留式磁珠的相对于该表面的垂直位置的测量然后报告上升的绝对值。 注意：为尽量减少漂移的后续影响，建议进行升相对的测量基准珠固定到表面的位置。 记录一个旋转曲线（该DNA扩展作为匝数的函数， 即测量）为≈0.25 PN（ 图2a）的拉伸力。 确定的圈数在该扩展是最大，因为此相对应的状态在其中DNA分子是扭转放松。要做到这一点，与抛物线或高斯函数来确定中心positi适合本​​地的旋转曲线是很有用的上。定义这个点为“零转弯”。 注意：用于此目的的自定义编写的例程可从应要求作者。 对于一系列〜20磁铁的位置，决定了扭转，轻松分子的平均延伸（ 即 “零转弯”，见步骤2.4.1）从z痕迹。 在步骤2.5各测量点，精确地确定从在 x或y的位置20，28，29中的波动的拉伸力，或者，设置在胎圈的磁化是众所周知的，使用局部磁场梯度4的知识。绘制的拉伸力与在力-伸展率曲线的平均延伸的结果（ 图2b）。 配合所产生的力-延伸数据使用多项式逼近布夏等 30蠕虫状链方程。 </l我> 如果准备以后FOMT测量，缓慢旋转的磁铁，而在录音（X，Y）的磁珠的短途旅行。 注意：得到的环状空间中的常规MT配置的半径越小，越紧密的DNA分子拴接近于“南极”的磁珠。当一个切换到FOMT配置，例如一个DNA分子会密切拴在“赤道”磁珠的，它使旋转角的可靠跟踪从（X，Y）的位置（见讨论）。 扭曲的DNA 3，测量使用的自由轨道磁性镊子通过一个用于FOMT（ 图1b）的圆筒形磁体手动替换正方形磁体的以往的磁镊子。此操作应以这样的方式所选择的DNA连接臂保持在视野内来进行。 <ol> 这可以通过简单地拧下完成磁铁头部持有磁体的常规镊子配置和被磁铁头部持有的圆筒形磁铁，FOMT替换它来完成，在不到1分钟。 磁珠由一个单一的dsDNA系绳拴在（X，Y）的偏移就相对于所述圆筒形磁体（ 图1b，图3a）的轴线系绳的位置强烈地依赖。记录的（X，Y）偏移，以便确定特征波动模式中的相应位置（ 图3a， 讨论）。 执行中的磁体名华的粗对准。这可以通过使用（X，Y）平移台移动的圆筒形磁体的流动池上面来实现。如果（x，y）的偏移遵循的弧形，圆柱形磁铁没有正确对齐和需要移动在适当的方向（ 图3b）。 粗对准可以在15分钟内完成对铭扬珠7.9 kbp的系绳的情况下，和完成时的（X，Y）偏移的结果，在观察圆周运动（ 图3b，中心）的测定。 注：粗定位通常是足够的观察结合到单一的DNA拴在名华配置由蛋白质而引起的变化，扭转21，31（代表结果， 图5），尽管随行的二维直方图可能没有它的计数绝对均匀地沿着圆形环（ 图3c）分布。 如果需要进一步的实验中，名华进行精细定位。这可以通过使用高分辨率微米螺丝或高分辨率自动阶段来移动磁体或流动池，以百分之实现呃圆柱形磁铁到胎圈到内〜10微米。在精对准阶段，磁铁仔细定位，使得在圆环形的波动几乎是均匀的，对应的情况下的能量势垒，以完整的旋转，由于磁铁为k（B T）（ 图4）。 注：一个MATLAB脚本在绘制直方图或热谱图的波动， 如图4可从应要求作者。 注：精细定位可以在45分钟内完成对铭扬珠7.9 KBP系绳的情况下，并在较小的珠子和系绳较短时间周期减少雇用（见讨论）。 注：精对准，通常需要进行裸或蛋白包被的DNA的扭转刚度的测量（代表结果， 图4）。 如果需要进行分析，校准的名华力。此，可以进行我呐以类似于MT，使用任一胎圈的<r 2>（其中，尖括号表示的时间平均值）中所示的附带视频和Lipfert 等[21]详细，或者，设置在胎圈的径向磁化的波动非常知的，使用本地磁场梯度21的知识。 4，DNA扭矩的使用磁力矩测量镊子手动替换是由一个圆筒形磁体加上一个侧面（永久）磁铁的MTT（ 图1c）用于FOMT的圆筒形磁体。此操作应以这样的方式所选择的DNA连接臂保持在视野内来进行。 最简单的方法来实现这一目标是手动添加的侧磁铁在其适当的位置，它可以在1分钟内完成。没有进一步的调整是必要的。 注意：一个替代的侧磁铁是利用的电磁铁32。 如果需要进行分析，校准类似的方式将力向MT，使用任一胎圈的x或y的波动，或者提供在胎圈的磁化是众所周知的，使用局部磁场梯度21的知识。 跟踪角速度波动使用无论是基于基准的跟踪协议，或23所示，影随行，根据监测（X，Y）的位置（见讨论）的角跟踪协议的时间θ（t）的函数。在前者的情况下，记录珠的完整图像作为时间用于随后的图像处理的功能。在后一种情况下，它足以在该步骤中，记录在胎圈的（X，Y）的波动。 注意：MATLAB脚本从珠作为时间的基准为基础的协议跟踪功能的全面图像确定θ（t）是根据要求从作者演示。 正如在讨论中所述，基于监测（X，Y）的位置，也是可取的记录时间轨迹，其中磁铁慢（通常在0.1赫兹）几圈旋转角跟踪协议。这将允许一个精确地转换笛卡尔坐标（x，y）变换为极坐标（r，θ）的使用讨论的方程3-5。 注意：MATLAB脚本的基础上监测（X，Y）的位置可从应要求作者角跟踪脚本。 注意：测量时间主要取决于所要求的转矩的分辨率。详细参数给出Lipfert 等[24]。对于铭扬珠和8 kbp的DNA的系绳，测量为30-100秒，应足以得到在1〜PN·20nm范围内的扭矩的分辨率。 确定扭转陷阱，从日刚度角波动电子用方差（σθ2，以弧度为单位）： K表θ= K（B T）/σθ2（1） 注：在MTT法实现典型的旋转陷阱刚度是在10-1000 PN·纳米/弧度，比传统的磁镊较低的范围内。 此外，记录珠的z位置，并以此来确定系绳长度 l（参见步骤2.4-2.7）。 旋转N匝并重新录制θ（t）和L（T）。 注意：MTT的还原旋转阱刚度相比MT使得它适合的单分子扭矩测量，但意味着能够施加的最大扭矩减小。这意味着，MTT可能无法抗衡引起的快速旋转高阻力扭矩。因此必须要注意不要超过最大速度;吨ypically旋转速率接近0.1赫兹。 确定在核酸系绳积累的扭矩N匝使用后： Γ= -钾θ<θ北 – θ0>（2） 其中<…>表示平均和θ0，θN的角度为零匝（对应于扭转宽松系绳，参见步骤2.3和N匝 ，分别。 重复，以充分确定一个单一的测量运行一个分子的转矩响应（代表结果， 图6）步骤4.5和4.6需要。