Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche

Determinazione quantitativa di reazioni biochimiche fornisce approfondimenti sui processi biologici alla base della vita. Calorimetria offre una metodologia libero-label per caratterizzare quantitativamente praticamente ogni reazione chimica in soluzione. Questa tecnica misura il calore rilasciato o assorbito nel tempo, ed è quindi un sistema di rilevamento universale e una metodologia molto comodo per quantificare la quantità di molecole reagenti (cioè termodinamica vincolanti), nonché per misurare la velocità di reazione (cioè cinetica). In particolare, Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stato adottato come metodo di scelta per caratterizzare la termodinamica di equilibri biomolecolari, coinvolgendo proteina-ligando, proteina-proteina, proteina-ioni metallici e le interazioni proteina-DNA ^1-6. Inoltre, la capacità di ITC di fornire informazioni cinetiche rende un sistema molto potente per misurare catalisi enzimatica, anche se il potenziale di questa applicazione è ancorasottovalutato ^7-9.

L'equazione di Michaelis-Menten ¹⁰ è una descrizione quantitativa di reazioni enzimatiche, in quanto fornisce una relazione tra la velocità di reazione e la concentrazione del substrato, a seconda di due parametri cinetici: la costante di Michaelis (K _M) e la costante di velocità catalitica (k _cat) . Il _gatto k / rapporto K _M viene definito come l'efficienza catalitica di un enzima. In pratica, la determinazione di K _M e K _gatto per una reazione specifica fornisce una descrizione completa della catalisi.

In una tipica reazione enzimatica (Figura 1), un substrato (S) interagisce con l'enzima (E) che formano il complesso enzima-substrato (ES), che viene successivamente attivato nello stato di transizione (ES *). Quest'ultimo viene convertito nel complesso enzima-prodotto (EP) che alla fine si dissocia. Questi steps sono descritti dalla seguente reazione.

(1)

dove k ₁ è la costante di velocità per la formazione del complesso ES, k _-1 è la costante di velocità per la dissociazione del complesso ES, mentre k _gatto è la costante di velocità catalitica o numero di turnover.

Secondo l'equazione di Michaelis-Menten ^10, la velocità di reazione può essere calcolato come:

(2)

in cui _M = K (k _-1 + k _cat) / k ₁ ek _cat = v _max / [E], con v _max essendo la velocità massima raggiunta quando tutti enzima è legato al substrato.

La titolazione calorimetro isotermico è lo strumento utilizzato in questo studio per caratterizzare l'idrolisi enzimatica dell'urea. Questo strumento è costituito da uno scudo adiabatico contenente due cellule a forma coniati (Figura 1). Questi sono collegati all'esterno con tubi accesso strette. La cella campione (ca. 1,4 ml) viene caricato con soluzione enzimatica, mentre la cella di riferimento è generalmente riempito con acqua o con il solvente utilizzato per l'analisi. Una siringa rotante con un lungo ago e una pagaia stir divisoria, generalmente comprendente ca. 0,3 ml di soluzione di substrato, è montato sulla cella campione. Un dispositivo termoelettrico misura la differenza di temperatura tra il campione e la cella di riferimento e, utilizzando una "rete di retroazione cella", mantiene questa differenza a zero aggiungendo o sottraendo calore. Durante l'esperimento, il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica a temperatura costante scelta. Quando l'enzymatic reazione ha luogo, la quantità di calore ceduto o assorbito è proporzionale al numero di molecole di substrato che vengono convertiti in molecole dei prodotti. Inoltre, il tasso di flusso di calore è direttamente correlata alla velocità di reazione. I dati misurati, che appare come una deviazione del tracciato calore dalla linea di base iniziale (Figura 1), rappresentano la potenza termica (μcal / sec) fornite dallo strumento alla cella campione, che è proporzionale al flusso di calore che si verificano nella cella campione nel tempo.

Figura 1. Rappresentazione schematica di titolazione isotermico calorimetro per studiare reazioni enzimatiche. Una reazione enzimatica si produce in conseguenza titolazione del substrato (prodotto nella siringa) nella soluzione enzimatica (nella cella campione) determina una variazione del therpotere mal rilasciato dal calorimetro, necessario per mantenere la differenza di temperatura tra la cella campione e la costante di cella di riferimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Nel complesso, la variazione di calore (Q) è proporzionale alla entalpia molare della reazione (AH) e il numero di moli di prodotto generato (n), che a sua volta è dato dai tempi totali di volume la concentrazione:

(3)

La formazione del prodotto nel tempo (dP / dt), che corrisponde alla velocità di reazione, può quindi essere correlato alla quantità di calore generato nello stesso tempo (dQ / dt) attraverso la relazione:

(4)

Secondo questa equazione, al fine di ottenere un Michaelis-Menten trama è necessario misurare i) il totale entalpia molare AH, e ii) il flusso di calore dQ / dt a differenti concentrazioni di substrato. Solitamente, questa viene eseguita in due diversi esperimenti: nel primo esperimento (metodo 1, M1), il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica e il calore per la conversione completa del substrato viene misurata; Nel secondo esperimento (metodo 2, M2), iniezioni multiple di substrato vengono eseguite e il tasso di produzione di calore viene misurato a differenti concentrazioni di substrato. Questi due insiemi di dati sono sufficienti per ricavare i parametri cinetici K _M e K _cat.

Nel presente articolo, un protocollo generale per determinare i parametri cinetici per le reazioni enzimatiche eseguite utilizzando ITC è descritto. Abbiamo applicato il metodo di urea all'idrolisi da Canavalia ensiformis urease, come un sistema di riferimento. Il buon accordo tra i risultati ottenuti con questo metodo e dei dati riportati in letteratura dimostra l'affidabilità di questo approccio.