חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל
Summary
לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.
Abstract
יונקים להיכשל בהתאוששות חושית ומוטורית בעקבות פציעה בעמוד השדרה בשל חוסר צמיחה מחודשת אקסון מתחת לרמה של פציעה, כמו גם חוסר יכולת reinitiate נוירוגנזה השדרה. עם זאת, כמה anamniotes כולל תערוכת rerio Danio דג הזברה הן חושית והתאוששות תפקודית גם לאחר חיתוך רוחב של חוט השדרה. דג הזברה המבוגר הוא אורגניזם מודל שהוקם לחקר התחדשות בעקבות פציעה בחוט השדרה, עם התאוששות חושית ומוטורית על ידי 6 שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את היתרונות של ניתוח vivo של תהליך ההתחדשות זמינים בדג זברת הזחל השקוף, כמו גם כלים גנטיים אינם נגישים במבוגרים, אנו משתמשים בדג זברת הזחל ללמוד התחדשות לאחר חיתוך רוחב של חוט השדרה. כאן אנו מדגימים שיטה לreproducibly וverifiably transecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, הנתונים שלנו מראה התאוששות חושית תחילת ב2 ימים לאחר פציעה (dpi), שנינותשעות תנועת C-עיקול לזיהוי על ידי 3 dpi וחידוש של שחייה חופשית בשיעור של 5 dpi. לכן אנו מציעים דג הזברה הזחל ככלי לוויה לדג הזברה המבוגר לחקר ההתאוששות לאחר פגיעה בחוט השדרה.
Introduction
טראומה גדולה לחוט השדרה האנושי לעתים קרובות תוצאות שיתוק ואיבוד התחושה מתחת לרמה של פגיעה קבוע, בשל חוסר היכולת לגדל מחדש אקסונים או reinitiate נוירוגנזה 1,2. בניגוד ליונקים, לעומת זאת, anamniotes כוללים סלמנדרות ודג זברה (Danio rerio) מראה התאוששות חזקה גם לאחר חיתוך רוחב חוט השדרה 3,4.
דג הזברה המבוגר הוא מודל מבוסס היטב ללימוד תהליך ההתאוששות לאחר פגיעה בחוט השדרה 5-7. בעקבות חיתוך רוחב חוט השדרה שלם, הקמתה מחדש של תפקוד חושי וקטר הוא ציין בדג הזברה המבוגר ב -6 שבועות שלאחר פציעה 8. על מנת לבחון את תהליך התחדשות in vivo, פנינו לדג זברת הזחל השקוף 9.
כאן אנו מציגים שיטה ותחצה את חוט השדרה של 5 ימים לאחר ההפריה USI דג הזברה (DPF) זחלng פיפטה משופעת microinjection כאזמל, שונה מהאט, et al. 10 שיטה זו תומכת בקצב העברת נתונים גבוה, תמותה נמוכה, ושחזור. בעזרת תרגול, ניתן transected 300 זחלים / שעה, ובמשך 6 חודשים של transections, כוללים מעל 3,600 בעלי חיים, 98.75% ± 0.72% שרדו עד 7 ימים לאחר פציעה (dpi). הנתונים שלנו מראה התאוששות מהירה של תנועה חושית וגם: בdpi 1, כל התנועה על ידי הדגים הפצועים היא מונעת על ידי תנועת סנפיר חזה בלבד. עם זאת, זחלים מתחילים להגיב למגע טונגסטן הזנב מחט לחיתוך רוחב של 2 dpi, להקים מחדש את תנועת C-עיקול על ידי 3 dpi, ולהציג את חיה טורפת בשיעור של 5 dpi 11. באמצעות מכתים נוגדן כנגד טובולין acetylated, יש לנו אישרו כי האקסונים נעדרים מאתר הפציעה בdpi 1, אבל חצינו את הפגיעה באתר על ידי 5 dpi. אנו מאמינים פרוטוקול זה יספק טכניקת ערך לחקר צמיחה מחודשת אקסון ונוירוגנזה בחוט השדרה בעקבות פציעה. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
כאשר בתחילה ללמוד את הטכניקה הזו, אנו ממליצים שתנסו לא יותר מ 50-100 transections בפגישה אחת. כאשר תשלטו בטכניקה זו, אנו מסוגלים transect עד 300 עובר לכל שעה; עם זאת, רמה זו של תפוקה דורשת כמה חודשים של תרגול שבועי. בנוסף, אנו ממליצים לתרגל עם קו כתב ואימות חיתוך רוחב מלא עד לשכיחות של ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו חייבים תודה למתקן דג הזברה אוניברסיטת יוטה לגידול בעלי חיים. RID נתמכה על ידי NIH R56NS053897, וLKB היה חניך predoctoral נתמך על ידי היוזמה HHMI Med-Into-הגראד.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
