Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven
Summary
Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.
Abstract
Säugetiere nicht in sensorischen und motorischen Erholung nach einer Rückenmarksverletzung aufgrund des Fehlens von axonalen Nachwachsen unter dem Niveau von Verletzungen sowie die Unfähigkeit, Rückenneurogenese wieder aufzunehmen. Doch einige anamniotes einschließlich der Zebrafisch Danio rerio Ausstellung auch nach der kompletten Durchtrennung des Rückenmarks sowohl sensorische und funktionelle Wiederherstellung. Die erwachsenen Zebrafisch ist ein Modellorganismus für das Studium Regeneration nach Rückenmarksverletzungen, mit sensorischen und motorischen Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der in vivo Analyse der Regenerationsprozess in der transparenten Larven Zebrafisch als auch genetische Werkzeuge nicht in der Erwachsenen zugänglich zu machen, verwenden wir die Zebrafisch-Larven, um die Regeneration nach Rückenmarksdurchtrennung zu studieren. Hier zeigen wir ein Verfahren zur reproduzierbar und nachweisbar Trennung des Larvenrückenmark. Nach Durchtrennung, zeigt unsere Daten sensorischen Erholung Anfang mit 2 Tagen nach der Verletzung (dpi), Witzh ist der C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und die Wiederaufnahme des freien Schwimmen von 5 dpi nachweisbar. So schlagen wir die Zebrafisch-Larven als Begleiter Werkzeug an die erwachsenen Zebrafisch für das Studium der Regeneration nach Rückenmarksverletzungen.
Introduction
Schweres Trauma an den menschlichen Rückenmarks oft zu bleibenden Lähmungen und Gefühlsverlust unterhalb der Ebene der Schädigung aufgrund der Unfähigkeit, die Axone wieder wachsen oder reinitiate Genese 1,2. Im Gegensatz zu Säugetieren, aber anamniotes einschließlich Salamander und Zebrafisch (Danio rerio) zeigen kräftige Erholung auch nach der kompletten Rückenmarksdurchtrennung 3,4.
Die erwachsenen Zebrafisch ist ein gut etabliertes Modell für die Untersuchung der Wiederherstellungsprozess folgende Verletzungen des Rückenmarks 5-7. Nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks, ist Wiederherstellung der sensorischen und Lok-Funktion im erwachsenen Zebrafisch von 6 Wochen nach der Verletzung 8 beobachtet. Um den Regenerationsprozess in vivo zu untersuchen, wandten wir uns an der transparenten Larven Zebrafisch-9.
Hier präsentieren wir eine Methode, um das Rückenmark zu durchtrennen eines 5 Tage nach der Befruchtung (DPF) Larvenzebrafisch using eine abgeschrägte Mikroinjektionspipette wie ein Skalpell, von Bhatt geändert, et al. 10. Diese Methode unterstützt hohen Durchsatz, geringe Mortalität und Reproduzierbarkeit. Mit etwas Übung können 300 Larven / h durchtrennt werden, und über 6 Monate von Querschnitten erhalten, darunter mehr als 3.600 Tiere, 98,75% ± 0,72% überlebten bis 7 Tage nach der Verletzung (dpi). Unsere Daten zeigen eine schnelle Wiederherstellung der sensorischen und Fortbewegung als auch: bei 1 dpi, wird jede Bewegung, die der Geschädigte Fisch nur Brustflosse Fortbewegung angetrieben. Allerdings Larven beginnen zu reagieren, um die Nadel zu berühren Schwanztrennung Wolfram von 2 dpi, wiederherzustellen C-Bogen-Bewegung um 3 dpi und zeigen räuberische Schwimm von 5 11 dpi. Mit Antikörperfärbung gegen acetyliertes Tubulin haben wir bestätigt, dass Axone fehlen in der Verletzungsstelle bei 1 dpi, haben aber die Verletzungsstelle um 5 dpi gekreuzt. Wir glauben, dass dieses Protokoll eine wertvolle Technik für die Untersuchung von axonalen Nachwachsen und Neurogenese im Rückenmark nach einer Verletzung bereitzustellen. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Wenn zunächst das Erlernen dieser Technik, empfehlen wir versuchen nicht mehr als 50-100 Querschnitten erhalten in einer einzigen Sitzung. Nach Beherrschung dieser Technik sind wir in der Lage, bis 300 Embryonen pro Stunde durchschneiden sich; aber dieses Niveau der Durchsatz erfordert ein paar Monaten der wöchentlichen Praxis. Wir empfehlen auch, gemeinsam mit einem Reporter-Linie und Überprüfung komplette Durchtrennung bis das Auftreten von unvollständiger Durchtrennung des Rückenmarks auf weniger als 1% reduzie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind auf die Universität von Utah Zebrafisch-Anlage für die Tierhaltung verschuldet. RID wurde von NIH R56NS053897 unterstützt und LKB war ein Promotions Auszubildenden durch die HHMI Med-In-Grad-Initiative unterstützt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm petri dish | VWR | 82050-544 | |
| 100mm petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm | Warner Instruments Inc. | 64-0778 | |
| forceps | Fine Scientific Tools Inc. | 11252-30 | |
| disssection microscope | Nikon | SMZ6454 | |
| microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Gentamycin Sulfate | Amresco Inc. | 0304-5G | dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C |
| Tricaine | Acros Organics | 118000100 | |
| cotton tipped applicator, wood, 6-inch | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| 1ml syringe | BD | 309625 | |
| 27 ga. needle | BD | 305109 | |
| Fry food | Argent Labs | F-ARGE-PTL-CN | store at -20°C |
| micropipette puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Box Filament FB330B |
| 20x E2 (1L) | store at RT | ||
| 17.5g NaCl | Fisher Scientific | S671-500 | |
| 0.75g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| 2.90g CaCl2·2H2O | Sigma | C7902-500G | |
| 4.90g MgSO4·7H2O | Merck | MX0070-1 | |
| 0.41g KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| 0.12g Na2HPO4 | Sigma | S0876-500G | |
| 500x NaCO3 (10ml) | make fresh, discard extra | ||
| 0.35g NaCO3 | Sigma | S5761 | |
| 1x E2 (1L) | store at RT | ||
| 50ml 20x E2 | |||
| 2ml fresh 500x NaCO3 |
References
- Houweling, D. A., Bär, P. R., Gispen, W. H., Joosten, E. A. Spinal cord injury: bridging the lesion and the role of neurotrophic factors in repair. Progress in brain research. 117, 455-471 (1998).
- Mikami, Y., et al. Implantation of dendritic cells in injured adult spinal cord results in activation of endogenous neural stem/progenitor cells leading to de novo neurogenesis and functional recovery. Journal of neuroscience research. 76 (4), 453-465 (2004).
- Chernoff, E. A. G., Sato, K., Corn, A., Karcavich, R. E. Spinal cord regeneration: intrinsic properties and emerging mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 361-368 (2002).
- Kuscha, V., Barreiro-Iglesias, A., Becker, C. G., Becker, T. Plasticity of tyrosine hydroxylase and serotonergic systems in the regenerating spinal cord of adult zebrafish. The Journal of comparative neurology. 520 (5), 933-951 (2012).
- Becker, C. G., Lieberoth, B. C., Morellini, F., Feldner, J., Becker, T., Schachner, M. L1.1 is involved in spinal cord regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (36), 7837-7842 (2004).
- Hui, S. P., Dutta, A., Ghosh, S. Cellular response after crush injury in adult zebrafish spinal cord. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 239 (11), 2962-2979 (2010).
- Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-dependent glial cell bridges facilitate spinal cord regeneration in zebrafish. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7477-7492 (2012).
- Reimer, M. M., et al. Motor neuron regeneration in adult zebrafish. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 28 (34), 8510-8516 (2008).
- Hale, M. E., Ritter, D. A., Fetcho, J. R. A confocal study of spinal interneurons in living larval zebrafish. The Journal of comparative neurology. 437 (1), 1-16 (2001).
- Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
- McClenahan, P., Troup, M., Scott, E. K. Fin-tail coordination during escape and predatory behavior in larval zebrafish. PloS one. 7 (2), (2012).
- Kim, C. H., et al. Repressor activity of Headless/Tcf3 is essential for vertebrate head formation. Nature. 407 (6806), 913-916 (2000).
