Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz

Aufgrund ihrer Fähigkeit, Lipidkörper unter bestimmten Stress-Bedingungen zu speichern, Algen haben eine große Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als potenzielle erneuerbare Energiequelle ^1,2 erhielt. Neutrale Lipide können über 60% des Trockengewichts der Zellen unter geeigneten Wachstumsbedingungen ³ entfallen. Doch die Industrie nicht eine einfache, saubere, schnelle und zuverlässige standardisiertes Protokoll zur Lipidgehalt der Algenzellen, um Bioprozess-Performance-Bildschirm für neue Stämme angemessen überwachen, Kulturen zu analysieren und zu quantifizieren.

Die Bligh-Dyer gravimetrischen Methode entwickelt, vor rund 50 Jahren noch zu den häufigsten Techniken heute ^4,5 verwendet. Während dieses Verfahren ist einfach, zuverlässig und einfach durchzuführen, ist es zeitraubend, erfordert große Probenvolumina, und macht Gebrauch von toxischen Lösemitteln. Es ist nicht praktisch für die Analyse von vielen Proben aus einer Fermentationslauf oder die Selektion von neuen ölreichen Stämme. Andere Verfahren haben been entwickelt, aber in der Regel verlangen, moderne Ausrüstung und wurden nicht standardisiert ^6.

Eine Alternative, die ein großes Interesse erregt hat ist der Nil Rote Fleck. Nile Red, ein Farbstoff, bevorzugt in unpolaren Umgebungen fluoresziert, wurde verwendet, um in verschiedenen Organismen einschließlich Nematoden ^{7, 8} Hefe-, ^{Bakterien-9, 10-19} und Algen zu identifizieren oder zu quantifizieren Lipidkörper. Erste Techniken mit Nile Red waren meist qualitative oder semi-quantitative, die Kombination der Fleck mit Single-Küvette Spektrophotometrie oder Durchflusszytometrie. Darüber hinaus sind einige Klassen von Algen wie Grünalgen haben dicke Zell Brunnen, die meist undurchlässig für den Farbstoff, der den Bereich der Technik ¹⁰ begrenzt sind.

Die jüngsten Verbesserungen an den Nil Rot-Färbung wurde berichtet, dass die anfängliche Mängel des Protokolls ^10,11 umgehen. Färbung der Zellen in der Gegenwart einer Carrier Lösungsmittel wie DMSO oder Ethanol ^{10 10,11} linearisiert die Beziehung zwischen Ölgehalt und Absorption, so dass für eine zuverlässige quantitative Messungen. Das Lösungsmittel hilft permeabilisieren die Zellmembran, so dass die Nile Red-Moleküle passieren können. Darüber hinaus, mit einem Spektralphotometer mit Mikro-Platte Lesefähigkeiten ermöglicht Hochdurchsatz-Protokolle geeignet für die quantitative Analyse.

In diesem Artikel werden wir ausführlich eine einfache Methode zur Messung der Ölgehalt der Algenzellen durch Färbung mit Nile Red Kulturen in Gegenwart von Ethanol, einem milden Lösungsmittel. Um möglichst genau entfallen Hintergrundrauschen in den Messungen wird eine Standardkurve korreliert Fluoreszenzintensität auf Ölgehalt Algenzellen mittels bekannter Ölzusammensetzung entwickelt. Das Verfahren wird von zuvor veröffentlichten Protokolle ^10,11 angepasst. Durch die Verwendung eines 96-Well-Spektrophotometer, ist man in der Lage, die gleiche Menge von Proben in einer Stunde tha analysierent würde Tage dauern, um durch gravimetrische Methoden überwachen. Weiterhin wird durch die Kalibrierung mit repräsentativen Stichproben des gewünschten Algenarten erzeugt dieses Verfahren relativ genaue Messungen, die direkt interpretierbar sind. Es gibt viele Protokolle skizziert Methoden der Färbung Algen mit Nil-Rot für unterschiedliche Belastungen und Anwendungen optimiert; Die hier vorgestellten Protokoll wurde ursprünglich von de la Hoz Siegler et al. ¹¹ Auxenochlorella protothecoides entwickelt, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus und Scenedesmus obliquus, obwohl es wahrscheinlich ist geeignet für viele Arten und Klassen. Es wurde mit der spezifischen Anwendung der Überwachungs Bioprozess Leistung konzipiert und funktioniert gleichermaßen gut für Proben zuvor getrocknet und nassen Proben von einer wachsenden Kultur.