Técnica de Subnormothermic<em> Ex Vivo</em> Perfusión hepática para el Almacenamiento, Evaluación y Reparación de marginales injertos hepáticos

Una visión general esquemática del protocolo se presenta en la Figura 1. Figura 1. protocolo de estudio. El diseño del estudio porcino de lesión hepática se basa en un modelo de donación después de la muerte cardíaca (DCD). Después de la disección de los vasos hepáticos, muerte cardiaca se induce seguido por 45 min de isquemia caliente injerto. Para simular un transporte de injerto entre los donantes y receptores hospitales en un entorno clínico, el injerto se almacena en hielo durante 4 h después de frío, de doble descarga. Después de almacenamiento en frío, el órgano se perfunde subnormothermic durante 6 horas con el fin de evaluar la estabilidad de perfusión. En un modelo de trasplante, el tiempo de perfusión podría ser más corto con el fin de recargar el almacenamiento de energía y para evaluar la viabilidad del órgano. Por favor, haga clic en élvolver a ver una versión más grande de esta figura. 1. Animales NOTA: los cerdos macho Yorkshire, 30-35 kg, se utilizaron para este estudio. Todos los animales recibieron atención humanitaria en el cumplimiento de los "Principios" de Laboratorio Animal Care '' formulados por la Sociedad Nacional para la Investigación Médica y la "Guía para el Cuidado de Animales de Laboratorio '", publicado por los Institutos Nacionales de Salud. El Comité de Cuidado Animal del Instituto de Investigación General de Toronto aprobó todos los estudios. 2. Recuperación de Órganos Casa masculinos cerdos Yorkshire en las instalaciones de investigación para 1 semana antes de la perfusión / trasplante para reducir el nivel de estrés y para acostumbrar a los animales a las condiciones de la vivienda. Menos de 2 días de alojamiento dentro de las instalaciones dará lugar a una reacción física inducida por el estrés, que puede alterar el resultado de la perfusión 22,23. Anestesiar cerdospor una inyección intramuscular (IM) de una mezcla de ketamina (25 mg / kg), atropina (0,04 mg / kg) y midazolam (0,15 mg / kg). Antes de la intubación, asegurar el cerdo respira espontáneamente 2 L de O 2 dosificado con 5% de isoflurano. Rocíe las cuerdas vocales con lidocaína al 2% 2 min antes de la intubación para evitar los espasmos de las cuerdas vocales. Por ejemplo, para un cerdo de 35 kg utilizar un fr 6.5. tubo traqueal. Bloquear el tubo traqueal con 3-5 ml de aire de la habitación. Después de la intubación, utilizar la capnografía para confirmar la correcta intubación. Bajar el gas isoflurano al 2%. Ajuste el ventilador para 14-16 respiraciones / min y un volumen corriente de 10 ml / kg de peso corporal. Coloque una (iv) catéter 20 G intravenosa en una de las venas de la oreja para permitir la infusión de solución de lactato de Ringer (200 ml por hora). Luego frote el cerdo y la cubrirá con paños estériles. Hacer una incisión de línea media seguido de una extensión lateral izquierdo. Use una toalla para cubrir los intestinos grandes y pequeños y colóquelos en el lado izquierdo. Infe separadavena cava rior (IVC) y la aorta distal entre sí; aorta se ramifica ligar a la parte de atrás; aislar y arterias renales libres del tejido adherente. Divida el ligamento falciforme y el ligamento triangular usando cauterio. Soltar la vena porta por una incisión del peritoneo entre el páncreas y la vena portal. Ate venas de drenaje del páncreas a la vena porta. Disecar el tronco celíaco por debajo de la vena porta y seguir hacia atrás a la aorta. Rodea la arteria mesentérica con un empate 2-0; rodear las arterias gástricas esplénica y de izquierda, que se ramifican posteriormente al tronco celíaco. Disecar el tronco celíaco de la vena porta. Ligar los vasos linfáticos en el ligamento hepatoduodenal para evitar fugas linfático. Divida la arteria gástrica derecha entre los lazos. Ligar las venas más pequeñas. Separe el conducto de la bilis desde el ligamento y se divide distalmente después de la ligadura. Diseccionar la aorta detrás del diafragma entre el corazón y tr celíacaunk; colocar un empate 2-0 alrededor de la aorta. Soltar el hígado a partir de la cava inferior en el lado derecho usando electro cauterización; utilizar tijeras para la parte superior, entre cava y el hígado. Retire la vesícula biliar y cauterizar vasos sangrantes de lecho vesicular. Administrar iv 1.000 UI / kg de peso del donante de Heparina. Para un modelo de DCD, inducir un paro cardiaco por inyección intracardiaca de 40 mEq KCl 3 min después de la administración de heparina. Conjunto paro cardiaco como el punto de partida de la isquemia caliente. Para la perfusión, recoger 1,6 L de sangre de cerdo en CPDA bolsas (citrato, fosfato, dextrosa, adenosina) inmediatamente después de la muerte cardíaca. Efectuar un lanzamiento suave (2000 xg sin freno). Retire el plasma y la capa leucocitaria en condiciones estériles (de bioseguridad de clase II del gabinete) y almacenar los eritrocitos en CPDA bolsas para transfusión. Vena porta cannulate y aorta con líneas de lavado de órganos. Ate los lazos establecidos con anterioridad en torno femoral, renal, esplénica, mesentérica, y el arte gástrica izquierdaerie, así como la aorta superior. Para un modelo de corazón latiendo donante (HBD), realizar la canulación de la aorta y la vena porta en condiciones latidos de su corazón. Después de 45 minutos de isquemia caliente, lavar el hígado con (UW) solución de la Universidad de Wisconsin usando doble perfusión a través de la aorta (bolsa de presión) y la vena porta (por gravedad). Cortar el hígado de cerdo, dejando a todos los buques que permanezcan mucho tiempo. Durante la preparación de back-mesa, sujetar la parte superior del IVC utilizando un Satinsky abrazadera y el hígado a eliminar una segunda vez con aproximadamente 0,5 L de solución de UW retrógradamente a través de IVC inferior hasta que el flujo de salida de la vena porta es clara. Ate todas las ramas arteriales de la aorta y tronco celíaco. Realizar una presión de perfusión arterial back-mesa con aproximadamente 0,5 l de solución de UW. Lave el conducto biliar usando solución UW. Cannulate las partes superior e inferior de la vena cava inferior utilizando un medio "x 3.8" reductores con Luer Lock; canular la vena porta y la arteria hepática utilizando 8.3 "; x 1/4 "y 1/4" x 3.8 "reductores con Luer Lock. Utilice la vena cava superior e inferior como drenaje venoso. Coloque el hígado en una bolsa de órganos, cerrar la bolsa de órganos, y almacenar el hígado en hielo hasta que se ha iniciado la perfusión. 3. ex vivo de perfusión de hígado Preparar la solución de perfusión que contiene la solución 2,000 ml Steen, 400 ml de eritrocitos lavados, 550 mg de piruvato de sodio, 100 ml de solución de ácido amino (10% Travasol), 10 mg de gluconato de calcio, 1000 IE de insulina de acción rápida, 1 g de cefazolina, 500 mg metronidazol, y 10.000 UI de heparina. Añadir otras moléculas de la vasodilatación, la inmunosupresión, la compactación de especies reactivas de oxígeno, o tratamiento con células del hígado basado en el protocolo de estudio particular. Para el componente de diálisis, utilizar dializado estándar que contiene 3,5 mM de potasio, bicarbonato 25 mM, glucosa 27 mM, así como 275 mg / L piruvato. Configure el circuito de perfusión (ver esquema de la figura 2). Figura 2. Circuito configurado. Viniendo desde el depósito principal como el punto de partida y final, la solución de perfusión es impulsado por una bomba centrífuga a través de un oxigenador. Justo después de la oxigenación de la solución, el circuito se divide en una línea más pequeña corriendo a una unidad de dializador para la homeostasis del electrolito y una línea más grande en ejecución a un filtro de leucocitos para la reducción de las células blancas de la sangre remanentes (WBC). La solución que se ejecuta a través del dializador devuelve al depósito principal. Después de que el filtro de leucocitos, el circuito se divide otra vez en 2 líneas iguales. Una línea funciona a alta presión (alrededor de 60 mm de Hg) directamente en la aorta para perfundir la arteria hepática. La otra línea desemboca en un segundo depósito. Desde este depósito se perfunde la vena portal. La presión de la perfusión portal depende de la energía de elevación de nivel de la solución del depósito (alrededor de 2-6 mm de Hg). Todos los fluidos son drobjetivó a través de la infraestructura y supra-hepática cava de vuelta al depósito principal. Para la reducción de la gravedad y la perfusión homogénea, el hígado se coloca en una piscina llena de agua con regulación de temperatura. Se separa del agua por una membrana impermeable y que nada en una suspensión de la perfusión. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Recoge todos los fluidos del circuito en un 3 L depósito (reservorio principal) y sujetar la salida. Conectar la salida a una bomba centrífuga seguido de un oxigenador comercial. Detrás del oxigenador, dividir el tubo en 2 líneas. Conecte una línea a un dializador y escurrir de nuevo en el depósito principal. Conecte la segunda línea a un filtro de reducción de leucocitos. Dividir la línea después del filtro de reducción de leucocitos en una línea arterial, que suministra solución de perfusión de la arteria hepática, y un portal vlínea endógeno entrega de solución de perfusión a un segundo depósito, que drena en la vena portal de salida por gravedad. Sujete la entrada del portal. Conecte la línea arterial a una línea de vena cava desemboca en el principal reservorio de recolección de líquidos. Para la recolección de ascitis o fuga de la solución de perfusión del hígado, preparar una línea de succión conectado al depósito principal. Soltar la abrazadera de flujo de salida desde el depósito principal y llenar el circuito con la solución de perfusión. Arranque la bomba centrífuga a 1500 revoluciones / min. La solución de perfusión conducirá a través de la línea arterial en la línea de la vena cava de vuelta al depósito principal. Asegúrese de que todo el aire es expulsado del circuito. Abra el suministro de gas para el oxigenador. Tome el hígado fuera del hielo. Enjuague la solución UW utilizando solución salina. Coloque el hígado, con su lado convexo hacia abajo para facilitar el acceso a los vasos, idealmente en un ambiente libre de gravedad para evitarcompresión de órgano en la superficie de contacto. Use un baño de agua y calor refrigerable. Ajuste la temperatura inicial del baño de circuito y el agua a 20 ° C. Cubra el baño de agua con una membrana impermeable y colocar el hígado en esa membrana. Reducir la gravedad de compresión impulsado por sumergir el hígado con una solución de perfusión. Reducir la velocidad de la bomba centrífuga a 1.000 revoluciones / min y colocar dos abrazaderas en la conexión de las líneas arteriales y la vena cava. Luego, cortar el tubo entre las abrazaderas. El uso de un conector de 3 vías, unir las dos salidas de cava y conectarlos a la línea de la vena cava. Suelte la abrazadera de la línea arterial, vierta la solución de perfusión en la cánula arterial de deshacerse de las burbujas, y conecte la línea a la cánula. Aumente la bomba centrífuga a 1.500 vueltas / min. Suelte la segunda pinza de la línea de la vena cava. Suelte la abrazadera del reservorio venoso portal a fin de llenarlo. Deje que la solución de perfusión verter en el portal cannula y conectarlo. Tenga especial cuidado de los niveles de líquidos estables en el depósito portal. Conecte las líneas de presión a las Esclusas de Luer de las cánulas arterial, portal y la vena cava. Para imitar las condiciones fisiológicas, aplicar tratamientos en el recipiente de la derecha. Inyectar la glucosa en la vena portal y no en la línea arterial con el fin de establecer un gradiente de imitar un mayor gradiente de glucosa venosa portal y la inducción de la síntesis de glucógeno 24,25. Después de conectar el hígado al circuito, elevar la temperatura a 33 ° C dentro de 60 min. Objetivo para un flujo arterial comenzando en alrededor de 250 ml / min a 40 mmHg. Esto puede llegar a 700 ml / min durante la perfusión una vez que la presión se incrementa hasta 70 mmHg. Al comenzar la temperatura, el objetivo de un flujo de la vena porta de 500-600 ml / min a 3-5 mmHg. Después de elevar la temperatura, controlar el flujo venoso portal, que aumentará hasta 1100 ml / min a 4-6 mmHg. Evite sobrepasar la presión portal por encima de physiologicavalores l (alrededor de 8 mmHg) para proteger fenestraciones sinusoidales 26. Evitar sobrepasar el flujo total por encima de 2.000 ml / min con el fin de evitar daños en el órgano. Ajuste el flujo de salida de -2 mmHg bajando el principal reservorio para evitar la congestión del hígado por la obstrucción del flujo funcional. Añadir el componente de diálisis para el circuito con el fin de equilibrar la solución de perfusión a los valores predeterminados 27. Ajuste el flujo de dializado de 500 ml / hr. Tome especial atención para ajustar el flujo de salida de diálisis para que la solución de perfusión se diluye ni tampoco se concentró. Dentro de la primera hora de la perfusión del depósito principal debe ser vigilado cuidadosamente! Asegurar la oxigenación del tejido homogéneo para recuperar y mantener la función del órgano mediante el uso de un principal componente de la mezcla de gas de O 2 (95-98%) y CO 2 (2-5%). Utilice gas variable durante la perfusión ya que el hígado cambia su metabolismo y su demanda pH durante la perfusión. Mantener un pH bajo durante el inicio deperfusión para proteger el órgano mediante el concepto de pH paradoja 28 y evitar daños graves en los tejidos que pueden resultar de conexiones rápidas a pH fisiológico bajo reoxigenación, ya que después de almacenamiento en solución UW, el órgano tenga un pH por debajo de 7 acidótico Ajustar la presión parcial de CO 2 continuamente a 25-30 mmHg modo que el pH alcance un nivel fisiológico dentro de 1 h. Añadir bicarbonato de sodio o de potasio para el circuito para lograr una concentración fisiológica de bicarbonato estándar en la solución de perfusión. Inyectar cuidadosamente bajo gas sangre repetitivo y control de electrolito. Vigilar la perfusión por periódico venosa y arterial de gases en sangre y AST análisis. El PO 2 venosa permanece por encima de 175 mmHg durante la perfusión. Monitorear el flujo y la presión vascular y nota una perfusión estable por una resistencia vascular constante. Mantener el sistema de perfusión estable durante un máximo de 8 horas. Al final del período ex vivo de perfusión, frescopor el sistema de perfusión a 20 ° C y, después de desconectar el tubo del circuito desde el hígado, enjuagar la solución de perfusión a cabo el hígado dualmente con solución UW hielo frío. Almacenar el hígado, una vez más colocado en hielo en una bolsa de órganos estéril.