Técnica de Subnormothermic<em> Ex Vivo</em> Fígado de Perfusão para o armazenamento, Avaliação e Reparação de enxertos de fígado Marginal

Uma visão geral esquemática do protocolo é apresentado na Figura 1. Figura 1 Protocolo do estudo. O desenho do estudo suíno de lesão hepática é baseada em uma doação pós-morte cardíaca modelo (DCD). Após a dissecção de todos os vasos do fígado, morte cardíaca é induzida seguido de 45 min de isquemia do enxerto quente. Para simular um transporte do enxerto entre o doador eo receptor hospitais em um ambiente clínico, o enxerto é armazenado no gelo durante 4 h após a frio, dual flush. Após o armazenamento a frio, o órgão é perfundido subnormothermic de 6 horas, a fim de avaliar a estabilidade de perfusão. Em um modelo de transplante, o tempo de perfusão podia ser encurtado, a fim de recarregar as baterias de armazenamento de energia e para avaliar a viabilidade de órgãos. Ao clicar elere para ver uma versão maior desta figura. 1. Os animais NOTA: suínos machos Yorkshire, 30-35 kg, foram utilizados para este estudo. Todos os animais receberam cuidados de acordo com as '' Princípios de Laboratório Animal Care '"formulados pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica e do' Guia para o Cuidado de Animais de Laboratório '", publicado pelo National Institutes of Health. O Comitê do Instituto Geral de Toronto Research Animal Care aprovado todos os estudos. 2 Órgão Retrieval Casa masculinos porcos Yorkshire em unidades de investigação para uma semana antes da perfusão / transplante para reduzir o nível de estresse e para acostumar os animais às condições habitacionais. Menos de 2 dias de alojamento dentro da instalação levará a uma reação física induzida pelo estresse, o que pode alterar o resultado da perfusão 22,23. Anestesiar porcospor uma via intramuscular (im) a injecção de uma mistura de cetamina (25 mg / kg), a atropina (0,04 mg / kg) e midazolam (0,15 mg / kg). Antes da intubação, garantir o porco respira espontaneamente 2 L de O 2 tratados com 5% de isoflurano. Pulverizar as cordas vocais com lidocaína a 2% 2 min antes da intubação para evitar espasmos nas cordas vocais. Por exemplo, para um porco 35 kg utilizar uma fr 6,5. tubo traqueal. Bloqueie o tubo traqueal com 3-5 ml de ar ambiente. Após a intubação, use a capnografia para confirmar a intubação correta. Abaixe o gás isoflurano a 2%. Defina o ventilador para 14-16 ciclos / min e um volume corrente de 10 ml / kg de peso corporal. Coloque a 20 L por via intravenosa (iv) do cateter numa das veias da orelha para permitir a infusão de uma solução de lactato de Ringer (200 ml por hora). Em seguida, esfregue o porco e cobri-lo com campos estéreis. Fazer uma incisão na linha média, seguido por uma extensão lateral esquerda. Use uma toalha para cobrir grandes e pequenas entranhas e movê-los para o lado esquerdo. INFE separadoveia cava rior (IVC) e aorta distais do outro; ramos da aorta ligam a parte de trás; isolar e artérias renais livres do tecido aderente. Divida o ligamento falciforme e do ligamento triangular com bisturi. Solte a veia porta por uma incisão do peritônio entre o pâncreas ea veia portal. Empate fora veias de drenagem do pâncreas para a veia porta. Dissecar o tronco celíaco abaixo da veia porta e segui-lo para trás, para a aorta. Cerque-se a artéria mesentérica com um empate 2-0; circundam as artérias esplênica e gástrica esquerda, que posteriormente ao ramo do tronco celíaco. Dissecar o tronco celíaco fora da veia portal. Ligadura dos vasos linfáticos dentro do ligamento hepatoduodenal para evitar vazamento linfático. Divida a artéria gástrica direita entre laços. Ligadura veias menores. Separe o ducto biliar do ligamento e dividi-lo distal após a ligadura. Dissecar a aorta por trás do diafragma entre coração e tr celíacaunk; colocar um laço 2-0 em torno da aorta. Solte o fígado a partir da cava inferior, no lado direito com bisturi eletro; use uma tesoura para a parte superior entre cava e fígado. Remover a vesícula biliar e cauterizar sangradores de leito da vesícula biliar. Administrar iv 1.000 IU / kg de peso do dador de heparina. Para um modelo de DCD, induzir parada cardíaca por injeção intracardíaca de 40 mval KCl 3 min após a administração de heparina. Definir parada cardíaca como o ponto de partida de isquemia quente. Para a perfusão, coletar 1,6 L de sangue de porco em CPDA sacos (citrato, fosfato, dextrose, adenosina) imediatamente após a morte cardíaca. Realizar uma rotação suave (2.000 xg sem freio). Remover o plasma eo creme leucocitário sob condição estéril (biossegurança classe gabinete II) e armazenar os eritrócitos no CPDA bolsas para transfusão. Veia portal e aorta canular com linhas de descarga do órgão. Amarre os laços estabelecidos anteriormente em torno femoral, renais, baço, mesentérica e arte gástrica esquerdaérie bem como a aorta superior. Para um modelo de coração batendo doador (HBD), realizar a punção da aorta e veia porta em condições coração batendo. Após 45 min de isquemia quente, lave o fígado com a solução (UW) da Universidade de Wisconsin usando dupla perfusão via aorta (saco de pressão) e da veia porta (gravidade driven). Corte o fígado de porco, deixando os restantes navios de comprimento. Durante a preparação para trás da mesa, prender o IVC superior usando um Satinsky prender e lavar o fígado uma segunda vez com cerca de 0,5 L de solução UW retrógrada via menor IVC até a saída da veia porta é clara. Empate fora todos os ramos arteriais da aorta e tronco celíaco. Executar uma perfusão pressão arterial back-mesa com cerca de 0,5 L de solução de UW. Lave o ducto biliar utilizando solução UW. Canular as partes superiores e inferiores do IVC usando meia "x 3/8", com redutores de Luer Lock; canular a veia porta e da artéria hepática por meio de 3/8 "; x 1/4 "e 1/4" x 3/8 "redutores com Luer Lock. Use a veia cava superior e inferior, como a drenagem venosa. Inserir o fígado num saco de órgãos, fechar o saco de órgãos, e armazenar o fígado em gelo até a perfusão foi iniciada. 3 Ex vivo fígado Perfusão Preparar a solução de perfusão contendo solução de 2,000 ml de Steen, 400 ml de eritrócitos lavados, 550 mg de piruvato de sódio, 100 ml de solução de amino ácido (10% Travasol), 10 mg de gluconato de cálcio, 1000 IE de insulina de acção rápida, 1 g de cefazolina, 500 mg de metronidazol e 10.000 UI de heparina. Adicionar outras moléculas para vasodilatação, imunossupressão, a eliminação de espécies reativas de oxigênio, ou o tratamento de células do fígado com base no protocolo de estudo particular. Para a componente de diálise, utilizar dialisado padrão contendo 3,5 mM de potássio, 25 mM de bicarbonato, glicose 27 mM, assim como 275 mg / l de piruvato. Configure o circuito de perfusão (esquema veja a Figura 2). Figura 2 circuito configurado. Vindo do reservatório principal como o ponto de partida e final, a solução de perfusão é impulsionado por uma bomba centrífuga por meio de um oxigenador. Logo após a oxigenação da solução, o circuito é dividida em uma linha de menor corrente para uma unidade para a homeostase do dialisador, e uma linha de electrólito maior execução de um filtro de leucócitos para a redução dos glóbulos brancos (WBC) remanescentes. A solução que funciona através do dialisador retorna para o reservatório principal. Depois de o filtro de leucócitos, o circuito divide-se novamente em duas linhas iguais. Uma linha funciona a alta pressão (cerca de 60 mm Hg) directamente no interior da aorta para perfundir a artéria hepática. A outra linha de drena para um segundo reservatório. A partir deste reservatório da veia porta é perfundido. A pressão da perfusão portal depende da energia de elevação do nível de solução do reservatório (cerca de 2-6 mm Hg). Todos os fluidos são drained elevação através da infra e supra-hepática cava de volta para o reservatório principal. Para a redução da gravidade e da perfusão homogénea, o fígado é colocado numa piscina cheia de água com temperatura regulada. Ele é separado da água por uma membrana impermeável e nada em uma suspensão de perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Colete todos os fluidos do circuito em um 3 L reservatório (reservatório principal) e apertar a saída. Conecte a saída de uma bomba centrífuga seguido por um oxigenador comercial. Atrás do oxigenador, dividir o tubo em duas linhas. Conecte uma linha de um dialisador e drená-lo de volta para o reservatório principal. Conecte a segunda linha para um filtro de redução de leucócitos. Dividir a linha após o filtro de redução de leucócitos para uma linha arterial, que fornece solução de perfusão da artéria hepática e um portal vlinha genas entregar solução de perfusão para um segundo reservatório, que escoa para dentro da veia portal de saída por gravidade. Prenda o ingresso portal. Conecte a linha arterial para uma linha de veia cava drenando para o principal reservatório para o recolhimento do fluido. Para a recolha de ascite ou de vazamento de solução de perfusão do fígado, preparar uma linha de sucção ligada ao reservatório principal. Libertar a braçadeira de saída do reservatório principal e encher o circuito com a solução de perfusão. Inicie a bomba centrífuga a 1500 rounds / min. A solução de perfusão irá conduzir através da linha arterial na linha de veia cava volta para o reservatório principal. Certifique-se de que todo o ar é expulso do circuito. Ligue o fornecimento de gás para o oxigenador. Pegue o fígado fora do gelo. Lave a solução UW utilizando solução salina. Inserir o fígado, com o seu lado convexo para baixo para facilitar o acesso aos recipientes, de preferência em um ambiente livre de gravidade para evitarcompressão de órgãos na superfície de contato. Use um banho de água calor e coolable. Ajuste da temperatura a partir do circuito de banho e água a 20 ° C. Cobrir o banho de água com uma membrana impermeável e colocar o fígado para que a membrana. Reduzir a gravidade compressão conduzido por submergir o fígado com solução de perfusão. Reduzir a velocidade da bomba centrífuga de 1000 voltas / min e colocar duas pinças para a ligação de linhas arteriais e vena cava. Em seguida, corte o tubo entre os grampos. Usando um conector de 3 vias, juntar as duas saídas de cava e conectá-los à linha de veia cava. Solte o grampo da linha arterial, derrame solução de perfusão na cânula arterial para se livrar de bolhas, e conecte a linha para a cânula. Aumentar a bomba centrífuga de 1500 voltas / min. Solte o segundo grampo da linha de veia cava. Solte o grampo do reservatório venoso portal, a fim de preenchê-lo. Vamos solução de perfusão despeje na Cannu portalla e ligá-lo. Tome especial cuidado dos níveis de fluido no reservatório estáveis ​​portal. Conecte as linhas de pressão para as Luer Locks das cânulas arterial, portal e de veia cava. Para imitar as condições fisiológicas, se aplicam os tratamentos para o vaso de direita. Injectar glicose na veia portal e não na linha arterial, a fim de estabelecer um gradiente de mimetizar um aumento do gradiente de glicose na veia porta e de induzir a síntese de glicogénio 24,25. Depois de ligar o fígado para o circuito, aumentar a temperatura até 33 ° C dentro de 60 min. Apontar para um escoamento a partir arterial em cerca de 250 ml / min a 40 mmHg. Isto pode chegar a 700 ml / min durante a perfusão, uma vez que a pressão é aumentada até 70 mmHg. Ao iniciar a temperatura, apontar para um fluxo da veia portal de 500-600 ml / min em 3-5 mmHg. Depois de elevar a temperatura, monitorar o fluxo venoso portal, que irá aumentar até 1.100 ml / min a 4-6 mmHg. Evitar de ultrapassar a pressão portal acima Physiologicavalores l (cerca de 8 mmHg) para proteger fenestrações sinusoidais 26. Evitar exceder fluxo total acima de 2.000 ml / min, de modo a evitar danificar o órgão. Defina o seu escoamento para -2 mmHg, diminuindo o reservatório principal para evitar congestão hepática por obstrução do fluxo funcional. Adicionar o componente de diálise para o circuito de modo a equilibrar a solução de perfusão para valores predeterminados 27. Definir o fluxo de dialisato de 500 ml / h. Tome especial atenção para ajustar o fluxo de saída de diálise de modo a que a solução de perfusão que não é diluído nem concentrada. Na primeira hora da perfusão o principal reservatório deve ser visto com cuidado! Assegurar a oxigenação do tecido homogéneo para recuperar e manter a função do órgão por meio de um componente principal da mistura de gases de O 2 (95-98%) e CO 2 (2-5%). Use gás variável durante a perfusão uma vez que o fígado muda o seu metabolismo e sua demanda pH durante a perfusão. Manter o pH baixo durante o início daperfusão para proteger o órgão com o conceito paradoxo pH 28 e evitar danos nos tecidos grave que pode resultar a partir de ligações rápidas para pH fisiológico sob reoxigenação, uma vez que depois de armazenamento em solução UW, o órgão tem um pH abaixo de 7 acidótica Ajuste da pressão parcial de CO 2 continuamente para baixo para 25-30 mmHg de forma a que o pH vai atingir um nível fisiológico a 1 hr. Adicionar bicarbonato de sódio-potássio ou para o circuito para atingir uma concentração fisiológica de bicarbonato de padrão na solução de perfusão. Injetá-lo cuidadosamente sob gás de sangue repetitivo e controle de eletrólitos. Monitorar a perfusão por gás de sangue venoso e arterial periódica e AST analisa. O PO venoso 2 permanece acima de 175 mmHg durante a perfusão. Monitorar o fluxo ea pressão vascular e observe a perfusão estável por uma resistência vascular constante. Manter o sistema de perfusão estável durante até 8 horas. No final do período de ex vivo de perfusão, frescoo sistema de perfusão a 20 ° C e, depois de desligar a tubagem do circuito do fígado, lavar a solução de perfusão para o fígado duplamente com uma solução de gelo frio de UW. Armazenar o fígado, uma vez mais colocados em gelo em um saco estéril de órgãos.