Techniek van Subnormothermic<em> Ex Vivo</em> Leverperfusie voor de opslag, Assessment, en reparatie van Marginal Lever Enten

Een schematisch overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. Figuur 1 Studie-protocol. De varkens studie ontwerp van leverschade is gebaseerd op een donatie na hartdood (DCD) model. Na dissectie van alle schepen de lever, wordt het hart van de dood veroorzaakt, gevolgd door 45 min van warme ischemie graft. Een graft transport tussen de donor en de ontvanger ziekenhuizen in een klinische omgeving te simuleren, wordt de transplantaat opgeslagen op ijs gedurende 4 uur na koude, dual flush. Na koude opslag, het orgaan subnormothermic geperfundeerde 6 h teneinde de perfusie stabiliteit te beoordelen. In een transplantatie model, kan de perfusie tijd korter om de opslag van energie op te laden en om de levensvatbaarheid van het orgaan te beoordelen. Klik hijopnieuw voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 1 Dieren OPMERKING: Man Yorkshire varkens, 30-35 kg, werden gebruikt voor dit onderzoek. Alle dieren kregen humane zorg in overeenstemming met de 'Principles of Laboratory Animal Care' 'door de National Society for Medical Research en de' Gids voor de verzorging van proefdieren 'gepubliceerd door de National Institutes of Health geformuleerd. De Animal Care Committee van de Toronto General Research Institute keurden alle studies. 2 Organ Retrieval Huis mannelijke Yorkshire varkens in onderzoek Faciliteiten 1 week vóór perfusie / transplantatie om het niveau van stress en de dieren wennen aan de huisvesting. Minder dan 2 dagen woningen in de inrichting leidt tot een stress geïnduceerde fysische reactie, waarbij de perfusie van 22,23 uitkomst kan veranderen. Verdoven van varkensdoor een intramusculaire (im) injectie van een mengsel van ketamine (25 mg / kg), atropine (0,04 mg / kg), en midazolam (0,15 mg / kg). Voorafgaand aan de intubatie, zorgen voor de varkenshouderij ademt spontaan 2 L van O 2 gedoseerd met 5% isofluraan. Spuit de stembanden met 2% lidocaïne 2 min voor intubatie om stembanden krampen te vermijden. Bijvoorbeeld, voor een 35 kg in een varken 6,5 fr. tracheatube. Blokkeer de tracheale tube met 3-5 ml lucht in de ruimte. Na intubatie, gebruiken capnometrie om correcte intubatie te bevestigen. Verlaag de isofluraan gas naar 2%. Zet het beademingsapparaat 14-16 ademhalingen / min en een tidal volume van 10 ml / kg lichaamsgewicht. Plaats een 20 G intraveneus (iv) katheter in een van de oor aderen infusie van Ringer's lactaat (200 ml per uur) mogelijk. Dan scrub het varken en dek deze af met steriele doeken. Maak een middellijn incisie gevolgd door een linker laterale extensie. Gebruik een handdoek om grote en kleine darmen te dekken en verplaats deze naar de linkerkant. Aparte Inferior vena cava (IVC) en distale aorta van elkaar; Ligeer aorta takken naar achteren; isoleren en vrij nierslagaders van aanhechtend weefsel. Verdeel de falciforme ligament en de driehoekige ligament met cauterisatie. Laat de poortader door een incisie van het buikvlies tussen de alvleesklier en de poortader. Afhechten aderen drainage van de alvleesklier naar de poortader. Ontleden de coeliakie kofferbak onder de poortader en volg deze naar achteren naar de aorta. Omringen de mesenterica met een 2-0 gelijkspel; omringen de milt en de linker maag slagaders, welke tak posterieur aan de coeliakie kofferbak. Ontleden de coeliakie stam uit de poortader. De lymfevaten in de hepatoduodenale ligament ligeren aan lymfatische lekkage te voorkomen. Verdeel de juiste maag slagader tussen de banden. Afbinden kleinere aderen. Scheid de galwegen van het ligament en verdeel het distaal na ligatie. Ontleden de aorta achter het membraan tussen hart en coeliakie trunk; Plaats een 2-0 gelijkspel rond de aorta. Laat de lever uit de onderste cava op de rechterkant met electro cauterisatie; Gebruik schaar voor het bovenste gedeelte tussen cava en lever. Verwijder de galblaas en cauterize bleeders uit galblaas bed. Dien iv 1.000 IE / kg donor gewicht heparine. Voor een DCD-model, veroorzaken hartstilstand door intracardiale injectie van 40 mval KCl 3 min na heparinetoediening. Stel een hartstilstand als het beginpunt van warme ischemie. Voor de perfusie, verzamel 1,6 L varkensbloed in CPDA zakken (citraat, fosfaat, dextrose, adenosine) onmiddellijk na hartdood. Voer een zachte draai (2.000 xg zonder rem). Verwijder het plasma en de buffy coat onder steriele toestand (bioveiligheid kast klasse II) en bewaar de erytrocyten in CPDA zakken voor transfusie. Canule poortader en aorta met orgel flush lijnen. Bind de eerder ingestelde banden rond dijbeen, de nieren, de milt, het mesenterium, en links maag kunsteries evenals de bovenste aorta. Voor een hart beating donor (HBD) model, voert u de infusen van de aorta en de vena porta onder hartslag voorwaarden. Na 45 min warme ischemie, spoelt de lever met de University of Wisconsin (UW) oplossing met behulp van dual perfusie via de aorta (druk zak) en de poortader (de zwaartekracht aangedreven). Snij de lever van het varken, alle resterende vaartuigen lang verlaten. Tijdens het back-tafel voorbereiding, klem de bovenste IVC met een Satinský klem en spoel de lever een tweede keer met ongeveer 0,5 L van de UW-oplossing retrogradely via lagere IVC totdat de poortader uitstroom is duidelijk. Bind alle arteriële takken van de aorta en coeliakie stam. Voer een arteriële back-tafel druk perfusie met ongeveer 0,5 L van UW-oplossing. Spoel de galwegen met UW-oplossing. Canule de bovenste en onderste delen van het IVC met 1/2 "x 3/8" verloopstukken met Luer Lock; canule de poortader en de leverslagader met 3/8 "; x 1/4 "en 1/4" x 3/8 "verloopstukken met Luer Lock. Met de bovenste en onderste vena cava veneuze drainage. Leg de lever in een orgaan zak, sluit het orgel zak, en bewaar de lever op ijs tot de perfusie is begonnen. 3 Ex vivo leverperfusie Bereid de perfusie-oplossing die 2000 ml Steen oplossing, 400 ml gewassen erytrocyten, 550 mg natrium pyruvaat, 100 ml aminozuur-oplossing (10% Travasol), 10 mg calcium gluconaat, 1000 IE snelwerkende insuline, 1 g cefazoline, 500 mg metronidazol, en 10.000 IU heparine. Voeg andere moleculen voor vaatverwijding, immunosuppressie, wegvangen van schadelijke soorten, of levercel behandeling op basis van de specifieke studie-protocol. Voor de dialyse component, gebruikt standaard dialysaat bevattende 3,5 mM kalium, 25 mM bicarbonaat, 27 mM glucose, en 275 mg / L pyruvaat. Stel de perfusiecircuit (schema zie figuur 2). Figuur 2 Circuit opgezet. Vanuit het belangrijkste reservoir als het startpunt en het eindpunt wordt de perfusie-oplossing aangedreven door een centrifugaalpomp via een oxygenator. Vlak na de zuurstofvoorziening van de oplossing, het circuit splitst in een kleinere lijn loopt naar een kunstnier unit voor elektrolyt homeostase en een grotere lijn loopt naar een leukocyt filter voor de vermindering van de overgebleven witte bloedcellen (WBC). De oplossing die door de dialysator loopt terug naar de belangrijkste reservoir. Na de leukocyt filter, het circuit weer splitst in 2 gelijke regels. Een lijn loopt bij hoge druk (ongeveer 60 mmHg) direct in de aorta naar de leverslagader perfuseren. De andere lijn uitmondt in een tweede reservoir. Vanuit dit reservoir de poortader wordt doorbloed. De druk van het portaal perfusie afhankelijk van de hoogte energie van het reservoir oplossing niveau (ongeveer 2-6 mmHg). Alle vloeistoffen zijn drained via de infra en supra-lever cava terug in het belangrijkste reservoir. Voor de zwaartekracht reductie en homogene perfusie, is de lever in een zwembad gevuld met de temperatuur geregeld water. Het wordt gescheiden van het water door een ondoordringbare membraan en het zwemt in een perfusie schorsing. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Verzamel alle vloeistoffen van het circuit in een 3 L reservoir (belangrijkste reservoir) en klem de uitstroom. Sluit de uitstroom naar een centrifugaalpomp gevolgd door een commerciële oxygenator. Achter de oxygenator, splitsen de slang in 2 lijnen. Sluit de ene lijn naar een kunstnier en laat het terug in het belangrijkste reservoir. Sluit de tweede lijn naar een leukocyten reductie filter. Splitsen van de lijn na de leukocyten reductie filter in een arteriële lijn, die perfusie-oplossing levert aan de leverslagader, en een portaal venous lijn, waarmee perfusie-oplossing naar een tweede reservoir, dat uitmondt in de poortader door de zwaartekracht uitstroom. Klem de portal instroom. Sluit de arteriële lijn om een ​​vena cava lijn afwateren in het belangrijkste reservoir voor vloeistof herinnering. Voor het verzamelen van ascites of lekken van perfusievloeistof van de lever, stelt een zuigleiding aangesloten op het reservoir. Laat de uitstroom klem van het belangrijkste reservoir en vul het circuit met de perfusie-oplossing. Start de centrifugaalpomp bij 1.500 rondes / min. De perfusie oplossing zal rijden door de arteriële lijn in de vena cava lijn terug in het belangrijkste reservoir. Zorg ervoor dat alle lucht wordt verdreven van het circuit. Zet de gastoevoer naar de oxygenator. Neem de lever uit het ijs. Spoelen van de UW-oplossing met behulp van een zoutoplossing. Plaats de lever, met zijn convexe zijde naar de toegang tot de vaartuigen, idealiter in een zwaarteloze omgeving te vermijdenorgel compressie op het contactoppervlak. Gebruik een warmte-en koelbaar waterbad. Stel de starttemperatuur van het circuit en waterbad tot 20 ° C. Bedek het waterbad met ondoordringbaar membraan en leg de lever op dat membraan. Verminder de zwaartekracht gedreven compressie door onderdompeling van de lever met perfusie-oplossing. Verminder het toerental van de centrifugaal pomp 1000 rounds / min en telkens twee klemmen aan de aansluiting van arteriële en vena cava lijnen. Snij vervolgens de slang tussen de klemmen. Met behulp van een 3-weg connector, sluit zowel cava uitstroom en sluit ze aan op de vena cava lijn. Maak de klem van de arteriële lijn, giet perfusie-oplossing in de arteriële canule om zich te ontdoen van de bubbels, en sluit de lijn naar de canule. Verhoog de centrifugaalpomp tot 1.500 rondes / min. Maak de tweede klem van de vena cava lijn. Maak de klem van de portal veneuze reservoir om het te vullen. Laat perfusieoplossing giet het in het portaal cannula en sluit deze. Wees extra voorzichtig van stabiele vloeistof niveaus in het portaal reservoir. Sluit drukleidingen naar de Luer Sloten van de arteriële, portal, en vena cava canules. Om fysiologische omstandigheden na te bootsen, toegepast behandelingen in de juiste vat. Injecteer glucose in de poortader en niet in de arteriële lijn teneinde een gradiënt nabootsen een verhoogde portale veneuze glucose gradient en induceren glycogeensynthese 24,25 stellen. Nadat de lever om het circuit binnen 60 minuten verhogen van de temperatuur tot 33 ° C. Streven naar een arteriële beginnend stroom op ongeveer 250 ml / min bij 40 mmHg. Dit kan 700 ml / min bereikt tijdens perfusie zodra de druk wordt verhoogd tot 70 mmHg. Bij het starten van de temperatuur, te streven naar een poortader stroom van 500-600 ml / min bij 3-5 mmHg. Na het verhogen van de temperatuur, toezicht houden op de portal veneuze flow, die zal toenemen tot 1.100 ml / min bij 4-6 mmHg. Voorkom het overschrijden portal druk boven Physiological waarden (ongeveer 8 mmHg) sinusvormige fenestraties 26 beschermen. Te overschrijden totale stroom boven 2000 ml / min teneinde te beschadigen het orgel. Stel de uitstroom naar -2 mmHg door de belangrijkste reservoir laten zakken om de lever congestie door functionele obstructie te voorkomen. Voeg de dialyse component naar het circuit om de perfusievloeistof naar vooraf bepaalde waarden 27 evenwicht. Stel het dialysaat stroom tot 500 ml / uur. Wees extra aandacht aan de dialyse uitstroom te passen, zodat de perfusie-oplossing is noch verdund of geconcentreerd. Binnen het eerste uur van de perfusie van de belangrijkste reservoir zorgvuldig moet worden bekeken! Homogene zuurstofvoorziening van de weefsels te herstellen en te handhaven orgel functie met behulp van een grote gasmengsel onderdeel van O 2 (95-98%) en CO 2 (2-5%). Gebruik variabele gas tijdens perfusie sinds de lever verandert het metabolisme en de pH vraag tijdens perfusie. Houd een lage pH tijdens de start van deperfusie van organen te beschermen met de paradox pH begrip 28 en voorkomen ernstige weefselbeschadiging die kan ontstaan ​​door snel naar fysiologische pH onder reoxygenation, aangezien na opslag in UW-oplossing, het orgel acidose pH lager dan 7 Stel de partiële druk van CO 2 continu naar 25-30 mmHg zodat de pH een fysiologische niveau binnen 1 uur bereikt. Voeg natrium of kaliumbicarbonaat om het circuit een fysiologische concentratie standaard bicarbonaat in de perfusie-oplossing. Injecteren zorgvuldig onder repetitieve bloed gas en elektrolyt controle. Bewaken van de perfusie door periodieke veneuze en arteriële bloed gas-en AST-analyses. De veneuze PO 2 blijft boven 175 mmHg tijdens de perfusie. Monitor vasculaire flow en druk en noteer een stabiele perfusie door een constante vaatweerstand. Houd de perfusie systeem stabiel voor maximaal 8 uur. Aan het einde van het ex vivo perfusie periode koellangs de perfusie systeem 20 ° C en, na het loskoppelen van de slangen circuit van de lever, spoel de perfusievloeistof de lever tweevoudig met ijskoude UW-oplossing. Bewaar de lever opnieuw op ijs geplaatst in een steriele zak orgaan.