Monitoramento de ativação do Padrão Antiviral Reconhecimento Receptores RIG-I e PKR por limitada Protease Digestão e PAGE nativo
Summary
Defesas inata de infecções por vírus são acionados por receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Os dois PRRs citoplasmáticos RIG-I e PKR ligam para RNAs virais de assinatura, mudança de conformação, oligomerizar e ativar sinalização antiviral. São descritos métodos que permitem monitorizar convenientemente a comutação conformacional e a oligomerização destes PRRs citoplasmáticos.
Abstract
Defesas do hospedeiro à infecção do vírus são dependentes de uma rápida detecção pelos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) do sistema imune inato. No citoplasma, PRRS RIG-I e PKR de ligação a ligandos específicos de RNA viral. Esta primeira medeia comutação conformacional e oligomerização, e, em seguida, permite a ativação de uma resposta interferon antiviral. Embora os métodos para medir a expressão do gene antiviral acolhimento estão bem estabelecidos, os métodos para monitorar diretamente os estados de ativação de RIG-I e PKR são apenas parcialmente e menos bem estabelecida.
Aqui, descrevemos dois métodos para monitorar estimulação RIG-I e PKR sobre a infecção com um indutor interferon estabelecido, o vírus da febre do Vale do Rift clone mutante 13 (Cl 13). Digestão de tripsina limitada permite analisar as alterações na sensibilidade da protease, indicando alterações de conformação de PRRS. Digestão de tripsina de lisados de simulações de células infectadas resulta em uma rápida degradação da RIG-I e PKR, whereainfecção s Cl 13 leva ao surgimento de um RIG-I fragmento resistente à protease. Também PKR mostra uma resistência parcial induzida por vírus para a digestão com tripsina, o qual coincide com a sua fosforilação marca em Thr 446. A formação de RIG-I e oligómeros PKR foi validado por electroforese em gel de poliacrilamida nativo (PAGE). Após a infecção, há um forte acumulação de RIG-I e complexos oligoméricos PKR, que estas proteínas permaneceram como monómeros em amostras infectadas simuladas.
Digestão protease limitada e PAGE nativa, ambos acoplados a análise western blot, permitir uma medição sensível e direta de dois diferentes etapas do RIG-I e ativação PKR. Estas técnicas são relativamente fácil e rápido de executar e não requer equipamento caro.
Introduction
Um acontecimento importante na defesa do hospedeiro antiviral é a detecção rápida do agente patogénico pelos chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) 1,2. Detecção intracelular de infecção por vírus de ARN é dependente de dois helicases de ARN citoplasmáticos, RIG-I (ácido retinóico gene indutível I) e MDA5 (diferenciação associado a melanoma de proteína 5) 3-5. RIG-I é composto por dois domínios N-terminais de recrutamento de caspase (cartões), um tipo de caixa de DECH-domínio RNA helicase central, e um domínio C-terminal (CTD) 4,6. Considerando que a CTD eo domínio helicase são necessários para o reconhecimento da não-auto (virais) RNAs, os cartões mediar sinalização a jusante levando ao estabelecimento de um estado anfitrião antiviral.
Se RIG-I está no estado de silêncio, isto é, na ausência de um ligando de ARN específico, a segunda placa interage com o domínio da helicase central e mantém RIG-I numa conformação auto-inibidora 7-11. RIG-I liga-se a curto duploARN de cadeia (ds) contendo um 5'-trifosfato (5'PPP), dsRNA longo, e RNA PolyU / UC-rico, estruturas clássicas de assinatura que estão presentes nos genomas de muitos vírus de ARN de 12-16. Duas características principais de ativação RIG-I é uma mudança para uma conformação fechada 6,17 eo homo-oligomerização 6,18,19. A mudança conformacional aumenta a ligação do RNA, expõe os cartões para sinalização a jusante, e reconstitui um site ATPase ativa 8,9,11,20. A formação de complexos oligoméricos RIG-I conduz a uma melhor recrutamento de moléculas adaptadoras de sinalização a jusante de modo a formar uma plataforma para a transdução de sinal antiviral 11. A cadeia de sinalização RIG-I-regulada, eventualmente, ativa o fator de transcrição IRF-3 para o aumento da regulação do interferon (IFN-alpha/beta) genes e, portanto, a expressão gênica de genes interferon estimulada (ISGs) por uma resposta antiviral completo 21,22 . Um dos ISGs melhor caracterizada é a protei activado ARNn quinase (PKR) 23. PKR pertence à família do factor de iniciação da tradução eucariótica 2 alfa (eIF2α) quinases e é composta de um domínio de cadeia dupla de RNA de ligação N-terminal e um domínio de cinase de terminal-C. O domínio cinase constitui a interface de dimerização crucial para a activação PKR e realiza as funções catalíticas da proteína. A ligação de PKR para dsRNA viral leva à sua alteração conformacional que permite a dimerização e auto-fosforilação em Thr 446 entre outros resíduos. PKR então medeia fosforilação de eIF2α, bloqueando assim a tradução de mRNAs viral 23-27.
Ambos RIG-I e PKR sofrer grandes rearranjos estruturais, formam complexos oligoméricas e são modificada após a tradução por fosforilação / desfosforilação e ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Para uma melhor compreensão do que as estruturas do RNA viral está ativando RIG-I e PKR (e em que estágio antagonistas virais poderia be interferindo), é importante para determinar com precisão o estado de activação. Para ambos os PRRs foi previamente descrito que a activação conduz ao aparecimento de fragmentos de proteína de tripsina-resistente 6,17,30 e oligómeros de ordem superior 6,18,19. No entanto, dada a riqueza da literatura sobre esses fatores-chave da resposta do hospedeiro antiviral 1,2,24, a aplicação de métodos diretos parece comparativamente raros. Na esperança de estimular o uso mais amplo, nós fornecemos protocolos convenientes e sensíveis para analisar de forma robusta os estados de ativação de RIG-I e PKR. O IFN competente linha celular humana A549 está infectado com um ativador estabelecido de RIG-I e PKR, o atenuado vírus da febre do Vale do Rift clone mutante 13 (Cl 13) 31,32. Depois de um procedimento de lise simples, os extratos de células infectadas são testados por tripsina digestão / western blot limitado para avaliar mudança conformacional, e pelo azul de eletroforese em gel de poliacrilamida nativa (PAGE) / analys Western bloté medir a formação de oligômeros.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sentindo a presença de vírus e ativação do tipo I IFN antiviral sistema são cruciais para a resposta imune inata de sucesso 22. A detecção de vírus é assim mediada por receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs) como RIG-I e PKR, permitindo uma resposta rápida e ativação de mecanismos de defesa anti-virais. Aqui, descrevemos dois métodos para avaliar diretamente o status de ativação de RIG-I e PKR.
Digestão protease limitada como uma ferramenta para monitorar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Alejandro Brun do CISA-INIA para fornecer anti-febre Rift Vale Vírus soros. Trabalho em nossos laboratórios é suportado por Forschungsförderung jóia. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, da Escola de Pós-Graduação Leibniz para doenças virais emergentes (EIDIS), o DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, ea DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
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