抗ウイルスパターン認識受容体RIG-IとPKRによって制限プロテアーゼ消化とネイティブPAGEの監視をアクティブ化

抗ウイルス宿主防御において重要な出来事は、いわゆるパターン認識受容体（PRR） ^の1,2による病原体の迅速な検出である。 RNAウイルス感染の細胞内検出は、2細胞質RNAヘリカーゼ、RIG-I（レチノイン酸誘導性遺伝子I）およびMDA5（メラノーマ分化関連タンパク質^5）3-5に依存している。 RIG-Iは、2つのN-末端カスパーゼ動員ドメイン（カードなど）、中枢DECHボックス型RNAヘリカーゼドメイン、およびC末端ドメイン^（CTD）4,6とから構成されている。 CTDおよびヘリカーゼドメインが非自己（ウイルス）RNAの認識に必要で​​あるのに対し、カードが抗ウイルスホストのステータスの確立につながる下流のシグナル伝達を仲介する。

RIG-Iが無音状態である場合、 すなわち、特定のRNAリガンドの非存在下で、第二のCARDは、中央ヘリカーゼドメインと相互作用し、自己阻害コンフォメーション^7-11にRIG-Iを保つ。 RIG-Iは、短い二本に結合する5'-三リン酸（5'PPP）、長いdsRNA、およびポリU / UC豊富なRNA、多くのRNAウイルス^12から16のゲノム上に存在する古典的な署名の構造を持つ鎖（DS）のRNA。 RIG-I活性化の二つの主要な特徴は、閉じたコンフォメー^6,17およびホモオリゴマー^6,18,19に切り替えている。コンフォメーションスイッチは、RNAが結合を増強下流のシグナル伝達のためのカードを公開し、活発なATPアーゼサイト^8,9,11,20を再構成する。オリゴマーRIG-I複合体の形成は、抗ウイルスシグナル伝達のためのプラットフォーム¹¹を形成するために、下流のシグナル伝達アダプター分子の増強された動員をもたらす。 RIG-I-調節されたシグナル伝達鎖は、最終的にアップレギュレーションインターフェロン（IFN-alpha/beta）遺伝子、完全な抗ウイルス応答^21,22インターフェロン刺激遺伝子（ISGの）の、従って遺伝子発現のための転写因子IRF-3を活性化する。最も特徴ISGの一つは、RNA活性化proteiですNキナーゼ^{（PKR）23。} PKRは、真核生物翻訳開始因子2アルファ（eIF2αリン）キナーゼのファミリーに属し、N末端の二本鎖RNA結合ドメインおよびC-末端キナーゼドメインから構成される。キナーゼドメインは、PKR活性化のための二量体化界面が重要で構成しており、タンパク質の触媒機能を実行する。ウイルスのdsRNAのPKRの結合は、他の残基の間のThr 446で二量体化および自己リン酸化を可能にする、そのコンフォメーション変化をもたらす。 PKRは、それによってウイルスmRNA ^23〜27の翻訳をブロックする、eIF2αリンのリン酸化を仲介する。

RIG-IおよびPKRの両方は、主要な構造再配列を受けるオリゴマー複合体を形成し、翻訳後リン酸化/脱リン酸化およびユビキチン化^{10,11,19,23,24,26-29}によって修飾される。ウイルスのRNA構造がRIG-IおよびPKRを活性化している（どのような段階でウイルスのアンタゴニストをbの可能性がより良い理解のためにe）に干渉し、それは正確に活性化状態を決定することが重要である。両方のPRRのために、予め活性化は、トリプシン耐性タンパク質断片^6,17,30及び高次オリゴマー^6,18,19の出現をもたらすことが記載されている。しかし、抗ウイルス宿主応答^1,2,24のこれらの重要な要因に関する文献が豊富に与えられ、直接法の適用は比較的まれと思われる。より広範な使用状況を刺激するのを期待し、我々は強固に、RIG-Iと、PKRの活性化状態を分析するために便利で敏感なプロトコルを提供する。 IFN有能なヒト細胞株A549は、RIG-IおよびPKR弱毒リフトバレー熱ウイルス変異体クローン13（CL ^13）31,32の確立された活性化因子に感染している。単純な溶解手順の後、感染細胞の抽出物は、コンホメーションのスイッチングを評価するために、制限されたトリプシン消化/ウェスタンブロット分析によって試験され、青色ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）/ウェスタンブロットによるanalysオリゴマーの形成を測定することである。