Suivi d'activation du motif de reconnaissance antiviraux récepteurs RIG-I et par PKR limitée protéase digestion et PAGE native

Un événement crucial dans la défense antivirale de l'hôte est la détection rapide de l'agent pathogène par les soi-disant récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) ^1,2. La détection intracellulaire de l'infection par le virus à ARN est dépendante de deux hélicases d'ARN cytoplasmique, RIG-I (gène inductible par l'acide rétinoïque I) et MDA5 (différenciation des mélanomes protéine associée 5) ^3-5. RIG-I est composée de deux domaines N-terminaux recrutement de caspase (CARDS), un domaine ARN hélicase de type DECH-caisson central, et un domaine C-terminal (CTD) ^4,6. Considérant que le CTD et le domaine hélicase sont nécessaires pour la reconnaissance de la non-autonomes (ARN viraux), les cartes médiation signalisation en aval conduisant à l'établissement d'un statut d'hôte antiviral.

Si RIG-I est à l'état silencieux, c'est à dire en l'absence d'un ligand d'ARN spécifique, la deuxième carte interagit avec le domaine hélicase central et maintient RIG-I dans une conformation d'auto-inhibition de ^7-11. RIG-I se lie à court doublebrin (ds) ARN portant un 5'-triphosphate (5'PPP), à long ARN double brin et l'ARN polyU / UC-riche, structures de signature classiques qui sont présents sur les génomes de nombreux virus à ARN ^{de 12-16.} Deux caractéristiques majeures de RIG-I activation sont un commutateur à une conformation fermée ^6,17 et l'homo-oligomérisation ^6,18,19. L'interrupteur conformationnel améliore liaison à l'ARN, expose les cartes pour la signalisation en aval, et reconstitue un site ATPase actif ^8,9,11,20. La formation de complexes oligomères RIG-I conduit à accroître le recrutement de molécules d'adaptateurs en aval de la signalisation pour former une plate-forme pour la transduction du signal ¹¹ antiviral. La chaîne de signalisation RIG-I-régulé éventuellement active le facteur de transcription IRF-3, pour la régulation de l'interféron (IFN-alpha/beta) gènes et par conséquent l'expression génique de gènes stimulés par l'interféron (ISG) pour une réponse antivirale complète ^21,22 . L'un des meilleurs ISGs caractérisé est le protei ARN activén kinase (PKR) ^23. PKR appartient à la famille du facteur d'initiation de traduction eucaryote alpha 2 (eIF2α) kinases et est composé d'un domaine de liaison à N-terminal de l'ARN double brin et un domaine de kinase C-terminal. Le domaine de kinase constitue l'interface de dimérisation cruciale pour l'activation de PKR et réalise les fonctions catalytiques de la protéine. Reliure de PKR à l'ARN double brin viral conduit à son changement de conformation permettant la dimérisation et l'auto-phosphorylation sur Thr 446 entre autres résidus. PKR produit ensuite la phosphorylation de eIF2α, bloquant ainsi la traduction des ARNm viral ^23-27.

Les deux RIG-I et PKR objet d'importants réaménagements structurels, former des complexes oligomères et sont modifications post-traductionnelles par phosphorylation / déphosphorylation et ubiquitination ^{10,11,19,23,24,26-29.} Pour une meilleure compréhension de laquelle les structures d'ARN viral activent RIG-I et PKR (et à quel stade antagonistes virales pourraient binterférant e), il est important de déterminer avec précision l'état d'activation. Pour les deux PRRs il a été précédemment décrit que l'activation conduit à l'apparition de fragments de protéine résistant à la trypsine ^6,17,30 et oligomères d'ordre supérieur ^6,18,19. Toutefois, compte tenu de la richesse de la littérature sur les facteurs clés de la réponse antivirale de l'hôte ^1,2,24, l'application de méthodes directes semble relativement rare. Dans l'espoir de stimuler l'utilisation plus large, nous fournissons des protocoles pratiques et sensibles pour analyser robuste les états d'activation de RIG-I et PKR. Le compétente A549 de lignée cellulaire humaine IFN est infecté par un activateur établi de RIG-I et de PKR, le virus de la fièvre de la Vallée du Rift atténué clone mutant 13 (Cl 13) ^31,32. Après une procédure de lyse simple, les extraits de cellules infectées sont testés par digestion à la trypsine / ouest analyse limitée blot pour évaluer commutation de conformation, et par le bleu natif gel de polyacrylamide (PAGE) / analys Western blotest de mesurer la formation d'oligomères.