Monitoring Activering van de antivirale Pattern Recognition Receptoren RIG-I en PKR Door Limited proteasedigestie en Inheemse PAGE
Summary
Aangeboren afweer tegen virus infecties worden veroorzaakt door patroonherkenning receptoren (PRRS). De twee cytoplasmatische PRRs RIG-I en PKR binden aan virale handtekening RNA's, verandering conformatie, oligomeriseren, en activeer antivirale signalering. Werkwijzen worden beschreven die laten gemakkelijk controleren conformationele schakelen en de oligomerisatie van deze cytoplasmatische PRRS.
Abstract
De afweer van virus infectie zijn afhankelijk van een snelle detectie van patroonherkenning receptoren (PRRS) van het aangeboren immuunsysteem. In het cytoplasma, het PRRS RIG-I en PKR binden aan specifieke virale RNA-liganden. Deze eerste bemiddelt conformationele schakelen en oligomerisatie, en voorziet activering van een interferon antivirale respons. Terwijl methoden om antivirale gastheer genexpressie te meten zijn goed ingeburgerd, methoden om de activering staten van RIG-I en PKR direct monitoren zijn slechts gedeeltelijk en minder goed ontwikkeld.
Hier beschrijven we twee methoden om RIG-I en PKR stimulatie na infectie met een gevestigde interferoninductor, de Rift Valley fever virus mutant kloon 13 (Cl 13) monitor. Beperkte trypsine digestie maakt wijzigingen analyseren protease gevoeligheid aangeeft conformatieveranderingen van het PRRS. Trypsinedigestie van lysaten van mock-geïnfecteerde cellen resulteert in een snelle afbraak van RIG-I en PKR, whereas Cl 13 infectie leidt tot de opkomst van een protease-resistente RIG-I-fragment. Ook PKR toont een virus-geïnduceerde gedeeltelijke resistentie tegen trypsinedigestie, die samenvalt met het keurmerk fosforylering op Thr 446. De vorming van RIG-I en PKR oligomeren werd gevalideerd door native polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Na infectie, is er een sterke ophoping van RIG-I en PKR oligomere complexen, dat deze eiwitten bleef monomeren in mock geïnfecteerde monsters.
Limited proteasedigestie en inheemse PAGE, beide gekoppeld aan western blot-analyse, zodat een gevoelige en directe meting van twee verschillende stappen van RIG-I en PKR activering. Deze technieken zijn betrekkelijk eenvoudig en snel uit te voeren en geen dure apparatuur vereisen.
Introduction
Een belangrijke gebeurtenis in antivirale afweer is de snelle detectie van de pathogeen door het zogenaamde patroonherkenning receptoren (PRRS) 1,2. Intracellulaire detectie van RNA-virus infectie is afhankelijk van twee cytoplasmatische RNA helicases, RIG-I (retinoëzuur induceerbare gen I) en MDA5 (melanoom differentiatie associated protein 5) 3-5. RIG-I bestaat uit twee N-terminale caspase recruitment domein (CARDS), een centrale soort DECH-box RNA helicase domein en een C-eindstandige domein (CTD) 4,6. Overwegende dat de CTD en de helicasedomein nodig zijn voor de erkenning van niet-zelf (virale) RNA's, de kaarten bemiddelen downstream signalering leidt tot de vestiging van een antivirale hoststatus.
Als RIG-I in het rustige toestand, dat wil zeggen in afwezigheid van een specifiek RNA-ligand, de tweede CARD samenwerkt met de centrale helicase domein en houdt RIG-I bij een auto-remmende conformatie 7-11. RIG-I bindt aan de korte double-streng (ds) RNA die van een 5'-trifosfaat (5'PPP), lange dsRNA en PolyU / UC-rijke RNA, klassieke handtekening structuren die aanwezig zijn op de genomen van vele RNA-virussen 12-16 zijn. Twee belangrijke kenmerken van RIG-I activering zijn een overstap naar een gesloten conformatie 6,17 en de homo-oligomerisatie 6,18,19. De conformatie schakelaar verbetert RNA-bindende, onthult de kaarten voor downstream signalering, en reconstrueert een actieve ATPase plaats 8,9,11,20. De vorming van oligomere RIG-I complexen leidt tot een verhoogde rekrutering van downstream signaling adapter moleculen om zo een platform voor antivirale signaaltransductie 11 te vormen. De RIG-I-gereguleerde signalisatie keten uiteindelijk activeert de transcriptiefactor IRF-3 voor up-regulatie van interferon (IFN-alpha/beta) genen en daarmee de genexpressie van interferon gestimuleerde genen (ISGs) voor een volledige antivirale respons 21,22 . Een van de best gekarakteriseerde ISGs de RNA-geactiveerde protein kinase (PKR) 23. PKR behoort tot de familie van eukaryotische translatie initiatie factor 2 alpha (eIF2α) kinasen en bestaat uit een N-terminaal dubbelstrengs RNA-bindend domein en een C-terminaal kinase domein. Het kinasedomein vormen de dimerisatie-interface cruciaal voor PKR activering en voert de katalytische functie van het eiwit. Binding van PKR om virale dsRNA leidt tot de vormverandering toelaat dimerisatie en auto-fosforylatie op Thr 446 onder andere resten. PKR bemiddelt dan fosforylering van eIF2α, waardoor de translatie van virale mRNAs 23-27 blokkeren.
Beide RIG-I en PKR ondergaan grote structurele herschikkingen, vormen oligomere complexen en zijn post-translationeel gemodificeerd door fosforylering / defosforylerings en ubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. Voor een beter begrip van die viraal RNA structuren activeren RIG-I en PKR (en in welk stadium virale antagonisten kon be storende), is het belangrijk om de activeringsstatus nauwkeurig te bepalen. Voor beide PRRs werd eerder beschreven dat activatie leidt tot het ontstaan van trypsine-resistente eiwitfragmenten 6,17,30 en hogere-orde oligomeren 6,18,19. Echter, gezien de grote hoeveelheid literatuur over deze belangrijke factoren van de antivirale gastheerreactie 1,2,24, toepassing van directe methoden lijkt betrekkelijk zeldzaam. In de hoop van het stimuleren van bredere gebruik, bieden wij handige en gevoelige protocollen krachtig analyseren de activering staten van RIG-I en PKR. De IFN bevoegde menselijke cellijn A549 is geïnfecteerd met een gevestigde activator van RIG-I en PKR, het verzwakt Rift Valley fever virus mutant kloon 13 (Cl 13) 31,32. Na een eenvoudige lyseren procedure worden de extracten van geïnfecteerde cellen getest door beperkte trypsinedigestie / western blot analyse conformationele schakelen evalueren en blauwe natieve polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) / Western blot analysis de vorming van oligomeren te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het aftasten van de aanwezigheid van virussen en activering van de antivirale type I IFN-systeem zijn van cruciaal belang voor een succesvolle aangeboren immuunrespons 22. Virusdetectie wordt daarbij gemedieerd door pathogeen herkenning receptoren (PRRS) zoals RIG-I en PKR, waardoor een snelle reactie en activering van antivirale afweermechanismen. Hier beschrijven we twee methoden om de activatie status van RIG-I en PKR direct evalueren.
Beperkte protease digestie als een instrum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Alejandro Brun van CISA-INIA voor het verstrekken van anti-Rift Valley fever virus sera. Werk in onze laboratoria wordt ondersteund door Forschungsförderung gem. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg, de Leibniz Graduate School for Emerging virusziekten (EIDIS), de DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021, en de DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cell culture | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 21969-035 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985-47 | |
| L-glutamine | PAA | 25030-024 | |
| penicillin-streptomycin | PAA | 15070-063 | |
| fetal calf serum (FCS) | PAA | 10270 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| chemicals | |||
| L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | |
| antibodies | |||
| mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) | Enzo Life Sciences | ALX-804-849-C100 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| mouse monoclonal anti-PKR (B10) | Santa Cruz | sc-6282 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) | Epitomics | 1120-1 | WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS |
| rabbit polyclonal anti-IRF-3 | Santa Cruz | sc-9082 | WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) | IBL | og-413 | WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS |
| rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) | Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA) | ||
| WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS | |||
| mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) | Cell Signalling | 3700 | WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit | Thermo Fisher | 0031460 1892914 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
| polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse | Thermo Fisher | 0031430 1892913 | WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS |
References
- Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
- Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
- Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
- Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
- Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
- Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. . A structure-based model of RIG-I activation. 18, 2118-2127 (2012).
- Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
- Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
- Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
- Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
- Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles’ recognition of 5′-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
- Pichlmair, A., et al. . RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. , 314-997 (2006).
- Hornung, V., et al. . 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , 314-994 (2006).
- Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
- Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
- Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
- Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
- Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
- Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
- Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
- Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
- Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
- Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
- Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
- Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
- Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
- Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
- Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
- Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
- Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5′-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
- Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
- Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
- Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
- Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
- Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
- Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
- Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
- Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
- Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
- Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
- Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).
