JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

تفعيل مراقبة من نمط المضادة للفيروسات الاعتراف المستقبلات RIG-I وPKR بواسطة البروتياز المحدودة الهضم وPAGE الأصلية

Published: July 29, 2014
doi:
10.3791/51415
,
1Institute for Virology,Philipps-University Marburg

Summary

يتم تشغيل الدفاعات الفطرية للعدوى الفيروس عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير). وهما خنازير حشوية RIG-I وPKR ربط إلى الرنا الفيروسي التوقيع، وتغير التشكل، oligomerize، وتفعيل الإشارات المضادة للفيروسات. يتم وصف الأساليب التي تسمح لرصد ملائم تبديل متعلق بتكوين وoligomerization هذه خنازير حشوية.

Abstract

دفاعات المضيف لعدوى فيروس تعتمد على الكشف السريع عن طريق مستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) من نظام المناعة الفطري. في السيتوبلازم، وخنازير RIG-I وPKR ربط إلى بروابط محددة RNA الفيروسي. هذا يتوسط أول تبديل متعلق بتكوين وoligomerization، ومن ثم تمكن من تفعيل استجابة للفيروسات المضادة للفيروسات. في حين وضعت أساليب لقياس التعبير الجيني للفيروسات المضيف بشكل جيد، وأساليب لمراقبة مباشرة للدول تفعيل RIG-I وPKR هي إلا جزئيا وأقل راسخة.

هنا، نحن تصف طريقتين لرصد RIG-I وPKR التحفيز على العدوى مع محفز مضاد للفيروسات المعمول بها، فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13). محدودة التربسين الهضم يسمح لتحليل التغيرات في حساسية الأنزيم البروتيني، مشيرا إلى التغييرات متعلق بتكوين جزئي للخنازير. التربسين هضم لست] من خلايا وهمية نتائج المصابة في التحلل السريع من RIG-I وPKR، whereaق الكلورين العدوى 13 يؤدي إلى ظهور مقاومة للالبروتيني RIG-I الجزء. أيضا PKR يظهر المقاومة التي يسببها فيروس جزئية لعملية الهضم التربسين، والذي يتزامن مع الفسفرة السمة المميزة لها في الثريونين 446. تشكيل RIG-I وجرى التحقق من الأوليغومرات PKR من قبل الأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE). على العدوى، وهناك تراكم قوية من RIG-I والمجمعات من oligomeric PKR، في حين ظلت هذه البروتينات كما مونومرات في عينات المصابة وهمية.

محدودة الهضم البروتيني وPAGE الأم، إلى جانب كل من لتحليل لطخة غربية، تسمح لقياس حساسية ومباشرة من خطوتين متنوعة من RIG-I وتفعيل PKR. هذه التقنيات هي سهلة نسبيا وسريعة لأداء ولا تتطلب معدات باهظة الثمن.

Introduction

A حدثا هاما في الدفاع المضيف المضادة للفيروسات هو الكشف السريع عن مسببات المرض عن طريق ما يسمى المستقبلات التعرف على الأنماط (خنازير) 1،2. الكشف عن الخلايا من عدوى فيروس الحمض النووي الريبي يعتمد على اثنين من helicases الحمض النووي الريبي حشوية، RIG-I (حمض الريتينويك الجينات محرض I) وMDA5 (ميلانوما التمايز بروتين يرتبط 5) 3-5. ويتكون RIG-I اثنين من المجالات N-محطة التوظيف كاسباس (بطاقات)، وهو نوع المركزية دتش مربع RNA helicase المجال، ومجال-C محطة (CTD) 4،6. في حين يطلب من CTD والمجال helicase للاعتراف غير المتمتعة بالحكم الذاتي (الفيروسية) الرنا، وبطاقات توسط إشارات المصب مما يؤدي إلى إنشاء حالة المضيف المضادة للفيروسات.

إذا RIG-I في حالة صامتة، أي في حالة عدم وجود الحمض النووي الريبي يجند محددة، يتفاعل البطاقة الثانية مع المجال helicase المركزية ويحتفظ RIG-I في السيارات المثبطة التشكل 7-11. RIG-I بربط قصيرة المزدوجحبلا (س) RNA تحمل 5'-ثلاثي الفوسفات (5'PPP)، طويلة الرنا المزدوج الجديلة، والجيش الملكي النيبالي polyU / UC-الغنية، والهياكل التوقيع الكلاسيكية التي هي موجودة على الجينوم من العديد من الفيروسات RNA 12-16. اثنين من الخصائص الرئيسية لتفعيل RIG-I هي التحول إلى التشكل مغلقة 6،17 وهومو oligomerization 6،18،19. مفتاح بتكوين يعزز الحمض النووي الريبي ملزمة، يعرض بطاقات للإشارات المصب، وreconstitutes موقع أتباز نشطة 8،9،11،20. تشكيل المجمعات RIG-I من oligomeric يؤدي إلى تعزيز توظيف المصب جزيئات محول الإشارات لتشكيل منبر للفيروسات نقل الإشارة 11. سلسلة إشارات RIG-I-تنظيم ينشط في نهاية المطاف عامل النسخ IRF-3 لمدة تصل التنظيم من الانترفيرون (IFN-alpha/beta) الجينات وبالتالي التعبير الجيني للفيروسات حفزت الجينات (ISGS) للاستجابة للفيروسات الكامل 21،22 . واحدة من أفضل ISGS تتميز البروتينات هو تنشيط الحمض النووي الريبين كيناز (PKR) 23. PKR ينتمي إلى عائلة حقيقية النواة ترجمة الشروع عامل ألفا 2 (eIF2α) تحركات ويتكون من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي ملزمة المجال-N محطة وكيناز C نطاق المحطة. يشكل المجال كيناز واجهة dimerization حاسمة لتفعيل PKR وينفذ وظائف الحفاز للبروتين. ملزمة من PKR لالرنا المزدوج الجديلة الفيروسية يؤدي إلى تغيير موقفها والسماح بتكوين dimerization وصناعة السيارات في الفسفرة في الثريونين 446 بين المخلفات الأخرى. PKR ثم يتوسط الفسفرة من eIF2α، وبالتالي عرقلة ترجمة الفيروسية mRNAs و23-27.

كلا RIG-I وPKR الخضوع لإعادة ترتيب هيكلية رئيسية، شكل مجمعات من oligomeric وتكون بعد translationally تعديلها من قبل الفسفرة / نزع الفسفات وubiquitination 10،11،19،23،24،26-29. من أجل فهم أفضل منها هياكل الحمض النووي الريبي الفيروسي يتم تفعيل RIG-I وPKR (وفي أي مرحلة مضادات فيروسية يمكن أن به التدخل)، من المهم أن تحدد بدقة حالة التنشيط. لكل من خنازير تم وصفها سابقا أن التنشيط يؤدي إلى ظهور مقاومة للشظايا البروتين التربسين 6،17،30 والعليا الأوليغومرات 6،18،19. ومع ذلك، وبالنظر إلى ثروة من الأدب على هذه العوامل الرئيسية للاستجابة للفيروسات المضيف 1،2،24، وتطبيق أساليب مباشرة يبدو نادرة نسبيا. أملا في تحفيز استخدام أوسع، ونحن نقدم بروتوكولات مريحة وحساسة لتحليل بقوة الدول تفعيل RIG-I وPKR. إصابة الإنترفيرون المختصة خط الخلية البشرية A549 مع المنشط أنشئت من RIG-I وPKR، والموهن فيروس حمى الوادي المتصدع استنساخ متحولة 13 (الكلورين 13) 31،32. بعد إجراء lysing بسيطة، يتم اختبار مقتطفات من الخلايا المصابة بواسطة محدودة التربسين الهضم / تحليل لطخة غربية لتقييم التحول متعلق بتكوين جزئي، والأزرق الأصلي هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE) / analys طخة غربيةهو قياس تشكيل الأوليغومرات.

Protocol

1. البذر من خلايا A549 للعدوى زراعة قارورة T75 الخلايا A549 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في خلية ثقافة المتوسط ​​(DMEM تستكمل مع FCS 10٪، 526.6 ملغم / لتر L-الجلوتامين، 50.000 U / البنسلين لتر، و 50 ملغ / لتر الستربتوميسين). <li style=";text-align…

Representative Results

الاعتراف ناهض الفيروسية من خلال سلفة-I أو مشغلات PKR تحويل متعلق بتكوين 6،17،30 6،18،27 وoligomerization. نحن يعاير هذه العلامات من قبل اثنين من تفعيل محدودة الهضم البروتيني والأم هلام بولي أكريلاميد الكهربائي (PAGE)، على التوالي. أصيب الخ?…

Discussion

الاستشعار عن وجود فيروسات وتفعيل نوع المضادة للفيروسات أنا الإنترفيرون النظام هي حاسمة لنجاح الاستجابات المناعية الفطرية 22. وبالتالي بوساطة الكشف عن الفيروس عن طريق المستقبلات الاعتراف الممرض (خنازير) مثل RIG-I وPKR، مما يتيح استجابة سريعة وتفعيل آليات الدفاع ال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر اليخاندرو برون من CISA-INIA لتوفير المضادة للفيروس حمى الوادي المتصدع الأمصال. ويدعم العمل في المختبرات لدينا من قبل Forschungsförderung الأحجار الكريمة. § 2 عبس. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum غيسن اوند ماربورغ، وكلية الدراسات العليا لايبنتز للالناشئة الأمراض الفيروسية (EIDIS)، وDFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021، وDFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cell culture
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Gibco 21969-035
OptiMEM Gibco 31985-47
L-glutamine PAA 25030-024
penicillin-streptomycin PAA 15070-063
fetal calf serum (FCS) PAA 10270
0.05% trypsin-EDTA Gibco 25300-054
chemicals
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin Sigma Aldrich T1426
antibodies
mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1) Enzo Life Sciences ALX-804-849-C100 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
mouse monoclonal anti-PKR (B10) Santa Cruz sc-6282 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446) Epitomics 1120-1 WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS
rabbit polyclonal anti-IRF-3 Santa Cruz sc-9082 WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS
rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386) IBL og-413 WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS
rabbit anti-RVFV hyperimmune serum "C2" (MP-12) Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)
WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS
mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10) Cell Signalling 3700 WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS
polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit Thermo Fisher 0031460 1892914 WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS
polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse Thermo Fisher 0031430 1892913 WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. . A structure-based model of RIG-I activation. 18, 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032 (2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles’ recognition of 5′-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. . RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5′-phosphates. , 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. . 5′-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5′-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287 (2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

Tags

RIG-IPKRPattern Recognition ReceptorsLimited Protease DigestionNative PAGEVirus InfectionRift Valley Fever VirusConformational ChangesOligomerizationAntiviral Response

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Weber, M., Weber, F. Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE. J. Vis. Exp. (89), e51415, doi:10.3791/51415 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image