غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص
Summary
وتفيد التقارير ان طريقة quantitating العدلات التصاق. هذا الأسلوب يخلق بيئة ديناميكية تدفق مماثلة لتلك التي واجهتها في أحد الاوعية الدموية. لأنها تتيح التحقيق في العدلات التصاق إما جزيئات الالتصاق المنقى (يجند) أو البطانية الركيزة الخلية (HUVEC) في سياق مماثل على البيئة في الجسم الحي مع الإجهاد الهائل.
Abstract
التصاق شركة العدلة إلى الخلايا البطانية يلعب دورا حاسما في التهاب في كل من الصحة والمرض. عملية التصاق شركة العدلة ينطوي على كثير من جزيئات الالتصاق مختلفة بما في ذلك أفراد الأسرة إنتغرين β 2 وبها مستقبلات لمكافحة الأسرة ICAM. في الآونة الأخيرة، والتي تحدث بشكل طبيعي المتغيرات الجينية في كل من β 2 لل integrins وذكرت ايكامس أن تترافق مع أمراض المناعة الذاتية. وبالتالي، فإن قدرة لاصقة كمية من العدلات من الأفراد مع اختلاف أشكال أليلية هذه جزيئات الالتصاق المهم دراسة فيما يتعلق الآليات الكامنة وراء تطور المناعة الذاتية. يمكن التصاق الدراسات في النظم غرفة التدفق خلق بيئة مع إجهاد القص السائل مماثلة لتلك التي لوحظت في البيئة الأوعية الدموية في الجسم الحي. هنا، نقدم طريقة استخدام نظام مقايسة غرفة التدفق لدراسة خصائص لاصقة كمية من الدم المحيطي الإنسان العدلةق الإنسان إلى الوريد السري البطانية الخلية (HUVEC) وركائز يجند المنقى. مع هذا الأسلوب، وقدرات لاصقة العدلة من الجهات المانحة مع المتغيرات أليلية مختلفة في مستقبلات الالتصاق يمكن تقييم ومقارنة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الأسلوب لتقييم التصاق غيرها من أنواع الخلايا الأولية أو خطوط الخلية.
Introduction
يتم التعرف على المتغيرات الجينية في كل من β 2 لل integrins وبروابط ICAM الآن لتترافق مع تطور 1،2 أمراض المناعة الذاتية. تحديد العواقب الوظيفية لهذه المتغيرات في الخلايا المشتقة من الأفراد مع هذه المتغيرات ضروري لفهمنا لكيفية مساهمة هذه المتغيرات إلى المرضية أمراض المناعة الذاتية. مثل هذه الدراسات وظيفية تسمح لتحديد الآليات التي تحدث بشكل طبيعي المتغيرات الجينية تشكل الاستجابة المناعية في كل من الصحة والمرض. في مثال محدد من SLE، ونحن نعلم الآن أن المتغيرات في ITGAM (CD11b) ويجند لها، ICAM-1، ربط بقوة مع تطور مرض 1،2. لأن العدلات هي الحاسمة في الاستجابات الالتهابية، ودراسة كمية من العدلات التصاق قد تقدم أفكارا الآلية في كيفية المتغيرات الجينية في ITGAM / ICAM تغيير الالتهاب.
NeutropHIL التصاق الخلايا البطانية لشركة (EC) هي عملية منظمة للغاية ويلعب دورا أساسيا في الاستجابات الالتهابية 3،4. التصاق شركة من العدلات يلي الأولي المتداول العدلة والقبض على المفوضية الأوروبية وفي نهاية المطاف يمكن أن يؤدي إلى التهجير في الجسم الحي. هذه العمليات تنطوي على العديد من أنواع مختلفة من جزيئات الالتصاق، بما في ذلك ICAM-1، ICAM-2، ف selectin، E-Selectin على الخلايا البطانية وβ 2 لل integrins على العدلة 5-9. وبالتالي، فإن القياس الكمي الدقيق للالعدلات التصاق من الجهات المانحة مع المتغيرات أليلية مختلفة من جزيئات الالتصاق يكون من المهم أن نفهم العواقب الوظيفية والمرضية لهذه المتغيرات الجينية.
استخدام تجريبي لغرفة تدفق يمكن أن تخلق بيئة في المختبر مع إجهاد القص السائل مماثلة لتلك التي لوحظت في البيئة الأوعية الدموية في الجسم الحي 10-12. في الواقع، مقايسة غرفة التدفق إلى جانب umbili الإنسانكال الخلايا البطانية الوريد (HUVEC) يمكن أن تحاكي البيئة في الجسم الحي في أحد الاوعية الدموية. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن للمرء أن دراسة خصائص لاصقة الخلوية مال نحو الخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك، البيئة رقابة شديدة من غرفة تدفق كما يسمح بتقييم خلية ملزمة لبروابط التصاق النقية مثل ICAM-1 لتسهيل دراسة التفاعلات مستقبلات يجند محددة.
نقدم هنا طريقة استخدام نظام مقايسة غرفة التدفق التصاق لدراسة خصائص لاصقة من العدلات الدم المحيطي الإنسان إلى HUVEC وركائز يجند المنقى. باستخدام هذا الأسلوب مع الخلايا من الجهات المانحة التعبير عن مختلف المتغيرات جزيء التصاق أليلية يسمح لنا لتقييم كيف يمكن لهذه المتغيرات الجينية يمكن أن يغير الإنسان التصاق شركة العدلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول توجه الانفصال والعزلة من العدلات تنشيط الحد الأدنى للتقدير الدقيق للالعدلات التصاق تحت ظروف الإجهاد الهائل. العدلات التصاق هو عملية حاسمة في الالتهاب. لأن أثبتت المتغيرات الجينية في جزيئات متعددة في هذه العملية ليؤهب لتطوير أمراض المناعة الذاتية 1،2، مطلوب نظام مقايسة قادرة على تقييم كمي الإنسان التصاق شركة العدلة. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح لتحديد الدقيق وكمية من إمكانات لاصقة شركة العدلات في بيئة تسيطر عليها في المختبر تحت الضغط الهائل. وبالتالي هذا الأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة لالتصاق العدلة الكمية بين الأفراد مرمزة بالجينات لتحديد أهمية الاختلاف الجيني في جزيئات الالتصاق 14.
العديد من الخطوات في هذا الأسلوب تستحق دراسة متأنية لتحقيقهنتائج ه الكمي للغاية وقابلة للتكرار. في إعداد HUVEC، فمن الأهمية بمكان لتحقيق 100٪ التقاء خلية قبل استخدامها في غرفة التدفق. لاستخدام أسطح مغطاة يجند النقي، لا ينبغي أبدا أن يسمح للمنطقة الركيزة طلاء لتجف لتجنب تغيير طبيعة يجند. بالإضافة إلى ذلك، إعداد العدلات الإنسان أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة. القضايا الرئيسية في عزل العدلات من الدم وتشمل التعامل مع بلطف عن طريق تقليل vortexing لتجنب التنشيط، والحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة (أي لا يجب أن يتم تخزين الدم على الجليد والطرد المركزي الخطوات التي ينبغي القيام بها في درجة حرارة الغرفة) واستكمال العزلة والتجربة في أقل قدر من الوقت ممكن. هناك طرق إضافية العدلة العزلة التي يمكن أيضا أن تستخدم لإعداد الخلايا لهذه المقايسات 17،18.
من العملية المقايسات المنظور، التصاق باستخدام العدلات الإنسان طازجة معزولة يجب أن تبدأ في غضون 3-6 ساعة بعد مشارك الفصد. كما العدلات حساسة للغاية للمناولة ويمكن الأزمنة المتطاولة بين سحب الدم والاستخدام تؤثر نتائج الفحص. تقرير دقيق للتركيز الخلية العدلة قبل مقايسة غرفة التدفق الضروري أيضا لتحقيق نتائج دقيقة وقابلة للتكرار.
خلال مقايسة غرفة التدفق، فمن المهم رصد وتسجيل الفيديو بدقة لضمان سرعة تدفق ثابت وليس هناك اضطرابات في جميع أنحاء طول التجربة. أن التغيرات في سرعات التدفق أو وجود اضطرابات تستلزم أن التجربة تتكرر. بعد التجربة، فإنه من المهم أيضا لتقييم العدلات المتبقية مجهريا للتأكد من أن العدلات لا التثاقل. سوف التثاقل عند هذه النقطة تشير إلى أن العدلات أصبحت تنشيط التي يمكن أن يغير بشكل كبير كثافة العدلات أثناء التجربة.
المحتويات "> وغرفة التدفق يخلق التوتر بالقرب متجانسة الهائل داخل غرفة (τ = 6Qμ / (ملحق 2)، حيث س = معدل التدفق، μ = اللزوجة الديناميكية، وث = العرض من غرفة التدفق، ح = ارتفاع غرفة تدفق 15). في دراساتنا، استخدمنا معدل تدفق 350 ميكرولتر / دقيقة لالعدلات التصاق، مما يخلق التوتر الهائل من 1.5 dynes / سم 2 (ث = 0.25 سم، ح = 0.01 بوصة، لزوجة الماء عند 37 درجة مئوية (0.007 اتزان) كانت تستخدم تقريبي لزوجة RMPI وسائل الإعلام). للحصول على غرفة تدفق محددة، يمكن للمرء تغيير معدل التدفق لتحقيق مستويات مختلفة من الإجهاد الهائل لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة. نموذجي إجهاد القص فيزيولوجي في الأوعية الدموية يمكن أن يتراوح بين الإنسان 0.5-5.0 dynes / سم 13،16. القص التوتر في الأوعية الدموية الأخرى، وكانت الحيوانات الأخرى المدرجة في الجدول 1 113،16،19 20.في حين ركزت أسلوبنا على دراسة التصاق neutrophi الإنسانليرة سورية، وهذه الطريقة لا يقتصر على العدلات ويمكن بسهولة أن تطبق على التصاق أو دراسات المتداول من أنواع الخلايا الأخرى مع تعديلات بسيطة. أيضا، وركائز في هذا الأسلوب يمكن أن تتغير لأغراض مختلفة.
على الرغم من أن هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة إلى دراسات مختلفة، وهناك بعض القيود. البروتوكول كما نفذت هنا يتطلب عدد كبير من الخلايا الأولية للتحليل. وهذا قد يحول دون تحليل الخلايا الأولية من الحيوانات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحاجة إلى شل بروابط التصاق المنقى في التشكل النشطة / المتوفرة قد تحد من مدى بروابط. استخدام البروتينات FC-الانصهار يعزز كثيرا من فرص تحقيق التشكل يجند المناسبة على سطح اللوحة. ومع ذلك، لدينا وسيلة لديه مرونة كبيرة للسماح للتحليل الكمي للالتصاق الأحداث. هذه الدراسات سوف يعزز إلى حد كبير فهمنا للالتصاق مستقبلات يجند أزواج، وظيفة الأهمية المحتملة من المتغيرات الجينيةفي هذه البروتينات، في التسبب في الأمراض التي تصيب الإنسان.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وترعى هذا العمل من قبل معهد أبحاث مرض الذئبة (نيويورك، نيويورك)، NIH P01-AR49084، NIH-R21 DA026956 والمعاهد الوطنية للصحة UL1-TR00165. نشكر الدكتور روبرت P. كيمبرلي على دعمه المتواصل.
Materials
| Table of Reagents Materials | |||
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Life technologies | 25200-056 | with Phenol Red |
| 2X Trypsin inhibitor | Life technologies | R-002-100 | |
| 35mm tissue culture dish | Corning Inc. | 430165 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| 75cm2 tissue culture flask | Corning Inc. | 430641 | Standard Tissue Culture Treated Surface |
| CCD camera | Dage-MTI | Model 300T-RC | |
| Cell freezing container | Biocision | BCS-045 | |
| EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | HUVEC growth basal medium |
| EGM-2 Bulletkit | Lonza Inc | CC-4176 | HUVEC growth factors for basal medium |
| FBS | Life technologies | 10082-147 | Certified, Heat Inactivated |
| Gelatin | Sigma | G9391 | from bovine skin |
| Hemacytometer | Fisher scientific | 02-671-51B | |
| Fibronectin | Sigma | F2006 | from human plasma |
| Flow chamber | Glyco Tech | 31-001 | Circular flow chamber for 35mm dishes |
| fMLP | Sigma | 47729 | |
| Histopaque-11191 | Sigma | 11191 | Heavy ficoll |
| HUVEC | Lonza Inc. | CC-2517A | |
| ICAM-1 | R&D systems | 720-IC | Fc chimera |
| Lymphocyte separation medium | Mediatech Inc. | 25072CV | Light ficoll |
| Microscope | Zeiss | Axiovert 100 | |
| RPMI 1640 medium | Life technologies | 11875 | with L-Glutamine and Phenol Red |
| Protein A | Sigma | P6031 | resuspend in PBS |
| P-Selectin | R&D systems | 137-PS | Fc chimera |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS270 | |
| TNF-a | Life technologies | PHC3015 | Recombinant Human Protein |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
References
- Harley, J. B., et al. Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants. in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).
- Kim, K., et al. Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations. Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).
- Ley, K. Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process. Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).
- Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders. J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).
- Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. Adhesion molecules and inflammatory injury. FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).
- Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).
- Marlin, S. D., Springer, T. A. Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen. Cell. 51 (5), 813-819 (1987).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65 (5), 859-873 (1991).
- Smith, C. W. Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review. Microcirculation. 7, 385-394 (2000).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).
- van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces. J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).
- Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies. Biophys. J. 67, 889-895 (1994).
- Kucik, D. F. Measurement of Adhesion Under Flow Conditions. Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).
- Zhou, Y., et al. Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils. Arthritis. Rheum. , (2013).
- Bacabac, R. G., et al. Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers. J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).
- Kucik, D. F., Wu, C. . Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., C, A., Zychlinsky, Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. J Vis Exp. 36 (36), (2010).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J Vis Exp. (17), 745 (2008).
- Cheng, C., et al. Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species. Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).
- Nagaoka, T., Yoshida, A. Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).
