Transcripción y metabolito de perfiles para la Evaluación de árbol Tabaco y Poplar como materia prima para la industria basada en Bio

1. Material vegetal Cultiva plantas Nicotiana glauca en 30 macetas cm de diámetro que contienen M2 medio de crecimiento profesional. Cultiva plantas en invernadero, con una temperatura diurna de 20 a 25 ° C y la temperatura nocturna de 15 º C. Utilice una luz de 16 horas y el ciclo de oscuridad de 8 horas como régimen de luz complementaria. 2. Preparación de la muestra Para metabolitos primarios: Materiales vegetales de la cosecha (hojas y tallos de N. glauca) y el material de congelación de inmediato. Liofilizar materiales vegetales congelados por liofilización durante tres días. Moler las muestras liofilizadas de molino mezclador con bolas de metal. Materiales secos Alícuota de tierra fina en un tubo de centrífuga de 2 ml o viales de vidrio. Para metabolitos secundarios: Tejidos de la planta de cosecha y material liofilizado inmediatamente. Moler los tejidos vegetales congelados por mmolino ixer con la bola de acero inoxidable o de mortero. Alícuotas tejidos de tierra fina en tubo de centrífuga de 2 ml (aproximadamente 20 mg de peso húmedo). 3. Protocolo de extracción para el metabolito de perfiles de metabolitos primarios por GC-MS Material de planta seca molida alícuota (10 mg de hoja y 20 mg de materiales madre) en 2 ml, tapón de rosca, tubos de fondo redondo. Añadir 1400 l de metanol al 100% y agitar durante 10 segundos. Añadir 60 l de Ribitol (0,2 mg / ml en H 2 O) como una norma cuantitativa interior y agitar durante 10 segundos. Añadir un acero inoxidable (o zirconia) pelota y homogeneizar el material con un molino mezclador durante 2 min a 25 Hz. Centrifugar la mezcla durante 10 min a 11.000 x g. Transferir el sobrenadante a un vial de vidrio. Añadir 750 l de cloroformo. Añadir 1500 l de H 2 O y agitar la mezcla durante 10 segundos. Transferir 150 l de lafase superior (fase polar) en un 1,5 ml tubo de centrífuga fresco. Las muestras secas usando un Speed ​​Vac. Es imperativo que las muestras se redujeron a sequedad para entre 3 y 24 horas hasta que no líquido residual está presente. Añadir 40 l de clorhidrato de metoxiamina (20 mg / ml en piridina). Agitar la mezcla en una coctelera bloque de calor horizontal durante 2 horas a 37 ° C. Añadir 70 l de N-metil-N – (trimetilsilil)-trifluoroacetamida mezcla MSTFA. Agitar la mezcla durante 2 horas a 37 ° C. Centrifugar las gotas en la tapa de una breve centrifugación ~ 1 min a 11.000 x g. Trasvasar el líquido en viales de vidrio apropiados para el análisis de GC-MS. 4. Extractor de metabolito de perfiles de metabolitos secundarios por LC-MS Añadir 500 l de metanol a las muestras de suelo helado. Agitar con un termomezclador durante 15 min a 70 ° C (1.000 seg -1). Centrifugar las muestras (5 millasN, 20.000 xg) y la fase líquida se transfirió a un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Liofilizar la fase líquida con un evaporador centrífugo (SpeedVac). Añadir 100 l de ciclohexano y 100 l de agua milliQ al sedimento seco. Agitar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente (uso de vórtice). Centrifugar las muestras (5 min, 20.000 xg). Transferir 80 l de la fase acuosa (fase inferior) a viales de inyección de LC-MS con fondo cónico para el análisis LC-MS. 5. Análisis de Datos Configurar Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 o 8 XCMS y seleccionar el análisis de los datos a ser procesados. Preparar una tabla de picos detectados de su interés, de acuerdo con la clase de compuesto de la Tabla 1. Identificar los picos por la co-elución de compuestos estándar. Anotar Posteriormente picos detectados mediante análisis MSN, algoritmos de caracterización estructural de 9,10, la literatura sENCUESTA y metabolito de búsqueda de base de datos 11,12. 6. Extracción de Hidrocarburos 13 Sumerja N. recién cosechado hojas glauca (~ 200 mg) en un disolvente (metanol, etanol, cloroformo, hexano o éter de petróleo (punto de 40-60 ° C o 60-80 ° C de ebullición) (5 ml; grado HPLC) de 2 a 20 min. Retire las hojas y secar completamente los disolventes por evaporación rotativa. Volver a suspender las muestras en hexano (1 ml; grado HPLC). Realizar análisis GC-MS mediante cromatografía de gases y con guión a un 5973MSD. Las condiciones de funcionamiento deben ser como sigue; gas portador, helio con un caudal de 0,9 ml min -1 / 11 psi. Inyectar muestras (1 mu l) con un inyector splitless a 280 ° C. Mantenga el horno de cromatografía de gases a 70 ° C durante 5 min antes de aumentar a 4 ° C / min hasta 320 ° C. Mantenga la temperatura final durante 10 minutos, lo que hace un tiempo total de 67,5 min. Configure la interfaz con el MS a 280 ° C y perform MS en el modo de barrido completo utilizando 70 eV EI + y escaneado de 10 a 800 D. Inicialmente procesar los componentes del cromatograma por deconvolución MS automatizada y un sistema de identificación, y los que se identifican utilizando la biblioteca NIST MS 98. Confirmar la identificación de hidrocarburos saturados de cadena larga alcano (hexacosenol, nonacosano, triacontano, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane y tritriacontane) mediante la comparación de los tiempos de retención y patrones de fragmentación clásicos a patrones auténticos conocidos. Determinar hidrocarburos cuantitativamente mediante la comparación de áreas de los picos integrados con las curvas de respuesta a la dosis (0,07 a 2,5 mg), construidos a partir de patrones auténticos. Calcular medios y error estándar de las medias (SEM) utilizando el software Excel. 7. Análisis de isoprenoides 14 Lleve a cabo una homogeneización tal como se describe en la sección 2. Pesar 10 mg de congelación homogeneizada polvo seco en un tubo de centrífuga. Añadir secuencialmente 250 ml de metanol sobre el polvo, se mezcla, a continuación, añadir 500 ml de cloroformo (grado reactivo de laboratorio), y se mezcla por agitación. Deje las muestras en hielo en la oscuridad durante 20 min. Añadir 250 ml de tampón Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) o agua (grado HPLC) a la suspensión y mezclar mediante agitación. Centrifugar la mezcla a 12.000 rpm (13.523 xg) durante 5 minutos para separar el no polar a partir de fases acuosas. La fase de cloroformo no polar que contiene extractos de isoprenoides es en la parte inferior. Transferir la fase a un nuevo tubo de centrífuga. Añadir un adicional de 500 ml de cloroformo a la fase acuosa, y llevar a cabo una segunda extracción por vórtice y centrifugación como se describió anteriormente. Combinar los extractos de cloroformo y llevar las muestras a sequedad en el evaporador y se almacenan a -20 ° C hasta su análisis. Añadir 50 ml de acetato de etilo (grado HPLC) para el extracto de isoprenoides se secó para redisolver el material. Inyectar 3 ml en una columna C18columna usando un módulo de separación ACQUITY UPLC. El gradiente utilizado para separar los pigmentos debe incluir; Un: metanol / H 2 0 (50:50) y B: acetonitrilo / acetato de etilo (75:25), y las condiciones iniciales debe ser un 30% (v / v) y B 70% (v / v) de ir a 100 % de B durante 6 min. Utilice una velocidad de flujo de 0,6 ml / min. Vigilar que el efluente continuamente con un arsenal de fotos diodo detector (PDA) 250-600 nm. Identificar los componentes de co-cromatografía y comparaciones espectrales entre patrones auténticos, beta caroteno (provitamina A), fitoeno, licopeno, luteína y zeaxantina. Realizar la cuantificación a partir de curvas de respuesta de dosis. Confirmar compuestos utilizando LC-MS; utilizar condiciones cromatográficas similares. La detección debe hacerse utilizando APCI ionización en modo positivo con un instrumento de Q-TOF. Hacer las modificaciones para la determinación de tocoferol con material seco 25 mg de congelación que se ha extraído y saponificación en 6% KOH a 50 ° C durante 1,5 h. <pclase = "jove_title"> el 8. Extracción de ARN de ARN Sec. Este protocolo combina la extracción de RNA de Trizol con un kit RNeasy para obtener ARN de alta calidad. Triturar 100 mg de material vegetal congelado en 2 ml tubos de centrífuga con una bola de metal por un molino mezclador. Añadir 1 ml de Trizol. Centrifugar el material durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de reacción. Añadir 200 l de cloroformo, invertir el tubo varias veces, y se incuba 3 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la mezcla durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C. Transferir la fase acuosa superior (aproximadamente 700 l) en un nuevo tubo de reacción. Añadir aproximadamente 2,5 volúmenes de etanol (100%), invertir el tubo varias veces, y se incuba durante 30 min a -80 ° C. Mueva la muestra incluyendo el posible precipitado la columna de centrifugación del kit. Centrifugar la columna durante 15 segundos a 8000 xg, y deseche la fbajo a través. Añadir 700 l de tampón RW1 a la columna de centrifugación y centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g. Deseche el flujo a través. Añadir 500 l de tampón RPE a la columna de centrifugación y centrifugar la columna durante 15 segundos a 8000 x g. Deseche el flujo a través. Añadir 500 l de tampón RPE a la columna de centrifugación y centrifugar durante 2 min a 8.000 x g. Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de reacción de 1,5 ml y añadir 50 l de agua libre de RNasa. Centrifugar la columna durante 1 min a 8000 xg para eluir el ARN. Retire ADN residual utilizando un Kit-ADN libre Ambion según las instrucciones del fabricante. Determinar la calidad de la ARN. El ARN debe tener números de la integridad del ARN (RIN) por encima de 8. Envíe de ARN para la secuenciación de próxima generación.