Transcrição e Metabolite Profiling de Avaliação dos Árvore Tabaco e Poplar como matéria-prima para a indústria baseada em Bio

1. Material vegetal Cultive plantas Nicotiana glauca em vasos 30 centímetros de diâmetro, contendo meio de cultura M2 profissional. Cultivar plantas em estufa, com uma temperatura diurna de 20-25 ° C e a temperatura nocturna de 15 ° C. Use uma luz de 16 horas e ciclo de escuridão 8 horas como regime de luz suplementar. 2. Preparação de Amostras Para metabólitos primários: Materiais de colheita de plantas (folhas e caules de N. glauca) e material de congelar imediatamente. Liofiliza materiais vegetais congelados por liofilização durante três dias. Moer amostras liofilizadas pelo misturador moinho com bolas de metal. Aliquota solo fino materiais secos para um tubo de centrífuga de 2 ml ou frasco de vidro. Para metabólitos secundários: Tecidos de plantas de colheita e o material congelar imediatamente. Moer tecidos vegetais congelados por mmoinho ixer com esfera de aço inoxidável ou almofariz e pilão. Alíquota finos tecidos moída em 2 ml tubo de ensaio (aproximadamente 20 mg de peso fresco). 3. Protocolo de Extração para Metabolite Profiling para primárias metabolitos por GC-MS Terreno alíquota material vegetal seco (10 mg de folhas e 20 mg de materiais tronco) em 2 ml, tampa de rosca, tubos de fundo redondo. Adicionar 1400 mL de metanol a 100% e de vórtice durante 10 seg. Adicionar 60 ul de Ribitol (0,2 mg imagens / ml em H2O) como um padrão interno e quantitativa de vórtice durante 10 seg. Adicionar um aço inoxidável (ou zircónio) bola e homogeneizar o material com um moinho misturador durante 2 minutos a 25 Hz. Centrifugar a mistura durante 10 min a 11.000 x g. Transferir o sobrenadante para um frasco de vidro. Adicionar 750 ul de clorofórmio. Adicionar 1500 mL de H2O e a mistura vortex durante 10 seg. Transferir 150 ul dafase superior (fase polar) em um tubo de 1,5 ml fresco centrífuga. As amostras secas usando uma velocidade vac. É imperativo que as amostras são reduzidas a secura para entre 3 e 24 horas, até que nenhum líquido residual está presente. Adicionar 40 ul de cloridrato de metoxiamina (20 mg / ml em piridina). Agitar a mistura em um bloco agitador horizontal calor durante 2 horas a 37 ° C. Adicionar 70 uL de N-metil-N – (trimetilsilil)-trifluoroacetamida MSTFA mistura. Agitar a mistura durante 2 horas a 37 ° C. Girar as gotas na tampa de uma breve centrifugação ~ 1 min a 11.000 x g. Transferir o líquido em frascos de vidro adequados para a análise de GC-MS. 4. Extraction para o metabolito Profiling para Secundária metabólitos por LC-MS Adicionar 500 mL de metanol para as amostras de solo congelado. Agitar com um termomisturador durante 15 min a 70 ° C (1,000 seg -1). Centrifugar as amostras (5 miN, 20.000 xg) e a fase líquida transferida para um tubo de centrífuga de 1,5 ml. Liofiliza-se a fase líquida com um evaporador centrífugo (Speedvac). Adicionar 100 ul de ciclo-hexano e 100 mL de água MilliQ ao sedimento seco. Agitar as amostras durante 5 min a temperatura ambiente (uso de vórtice). Centrifugar as amostras (5 minutos, 20.000 xg). Transferir 80 uL da fase aquosa (fase inferior) para LC-MS frascos de injecção com o fundo cónico para análise por LC-MS. 5. Análise de Dados Configure Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 ou 8 XCMS e selecione a análise dos dados a serem processados. Prepara-se uma tabela de picos detectados de seu interesse, de acordo com a classe de compostos na Tabela 1. Identificar picos de co-eluição de compostos padrão. Posteriormente anotar picos detectados através da análise de MSN, algoritmos de caracterização estrutural 9,10, literatura survey e do metabolito de pesquisa de banco de dados 11,12. 6. Hidrocarbonetos Extraction 13 Submergir N. recém-colhida folhas glauca (~ 200 mg) em solvente (metanol, etanol, clorofórmio, hexano ou éter de petróleo (ponto de ebulição 40-60 ° C ou de 60-80 ° C) (5 ml; grau HPLC) de 2 a 20 min. Retire as folhas e secar completamente solventes por evaporação rotativa. Suspenda as amostras em hexano (1 ml; grau HPLC). Realizar análise de GC-MS utilizando cromatografia gasosa e com hífen a um 5973MSD. Condições de funcionamento deve ser a seguinte; gás veículo, hélio com uma velocidade de fluxo de 0,9 ml min -1 / 11 psi. Injetar amostras (1 mL) com um injetor splitless a 280 ° C. Segurar o forno de cromatografia gasosa, a 70 ° C durante 5 min antes de acelerar a 4 ° C / min até 320 ° C. Mantenha a temperatura final durante mais 10 minutos, perfazendo um tempo total de 67,5 minutos. Definir a interface com a MS a 280 ° C e perform MS no modo de varredura completa usando 70 eV EI + e digitalizados 10-800 D. Inicialmente processar os componentes cromatograma deconvolution MS automatizado e sistema de identificação, e aqueles que são identificados usando a biblioteca NIST 98 MS. Confirmar a identificação de hidrocarbonetos saturados de comprimento de cadeia de alcano (hexacosenol, nonacosano, triacontano, octacosenol, nonacosonal, hentriacontano, dotriacontane e tritriacontane) por comparação dos tempos de retenção e os padrões de fragmentação clássicos de padrões autênticos conhecidos. Determinar hidrocarbonetos quantitativamente por comparação das áreas de pico integradas, com curvas de resposta à dose (0,07-2,5 mg), construída a partir de padrões autênticos. Calcular médias e erro padrão da média (SEM) utilizando o programa Excel. 7. Análise de isoprenóides 14 Realize homogeneização como descrito na seção 2. Pesar em 10 mg de congelamento homogeneizado pó seco em um tubo de centrífuga. Adicionar sequencialmente 250 ml de metanol para o pó, misture, em seguida, adicione 500 ml de clorofórmio (laboratório de grau reagente), e misture por vórtex. Deixar as amostras em gelo no escuro durante 20 min. Adicionar 250 ml de tampão Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) ou água (qualidade HPLC) para a suspensão e misturar por vortex. Centrifugar a mistura a 12.000 rpm (13.523 x g) durante 5 minutos para separar o apolar de fases aquosas. A fase de clorofórmio contendo extractos de isoprenóides não polar é na parte inferior. Transferir a fase para um novo tubo de centrífuga. Adicionar mais 500 mL de clorofórmio adicional para a fase aquosa, e proceder a uma segunda extracção por vórtice e centrifugação como descrito acima. Combinar os extractos de clorofórmio e trazer as amostras até à secura utilizando o evaporador e armazenar a -20 ° C até à análise. Adicionar 50 ml de acetato de etilo (qualidade para HPLC) para o extracto de isoprenóide seco para dissolver o material. Injectar 3 ml num C18coluna, utilizando um módulo de separação de UPLC Acquity. O gradiente utilizado para separar os pigmentos devem incluir; A: metanol / H 2 0 (50:50) e B: acetonitrilo / acetato de etilo (75:25), e as condições iniciais deve ser um 30% (v / v) e B de 70% (v / v), indo a 100 % B durante 6 min. Use uma taxa de fluxo de 0,6 ml / min. Monitore o fluido continuamente com uma matriz Foto Diode (PDA) detector 250-600 nm. Identificar os componentes por co-cromatografia e comparações espectrais entre padrões autênticos, betacaroteno (provitamina A), fitoeno, licopeno, luteína e zeaxantina. Realizar a quantificação das curvas de resposta à dose. Confirme compostos utilizando LC-MS; usar condições cromatográficas similares. Detecção deve ser feito utilizando APCI no modo de ionização positiva com um instrumento Q-TOF. Fazer as modificações para a determinação de tocoferol com material seco de 25 mg de congelação que tenha sido extraído e saponificação em 6% de KOH a 50 ° C durante 1,5 horas. <pclass = "jove_title"> 8. Extração de RNA para RNA Seq Este protocolo combina extração de RNA Trizol com um Kit RNeasy obter RNA de alta qualidade. Moer 100 mg de material vegetal congelado em 2 ml de tubos de centrífuga com uma bola de metal por um moinho misturador. Adicione 1 ml de Trizol. Centrifugar o material durante 10 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de reacção. Adicionar 200 ul de clorofórmio, inverter o tubo várias vezes, e incubar 3 minutos à temperatura ambiente. Centrifugar a mistura durante 15 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C. Transferir a fase aquosa superior (aproximadamente 700 ul) para um novo tubo de reacção. Adicionar cerca de 2,5 volumes de etanol (100%), inverter o tubo várias vezes, e incubar durante 30 min a -80 ° C. Mova a amostra incluindo qualquer precipitado para a coluna de spin do kit. Centrifugar a coluna por 15 segundos a 8.000 xg, e descartar o fbaixo completamente. Adicionar 700 mL de buffer RW1 à coluna de spin e centrifugar por 15 segundos a 8.000 x g. Descartar o fluxo através. Adicionar 500 mL de buffer RPE para a coluna de rotação e centrifugar a coluna por 15 segundos a 8.000 x g. Descartar o fluxo através. Adicionar 500 ul de tampão de RPE para a coluna de centrifugação e centrifugar durante 2 minutos a 8.000 x g. Colocar a coluna de centrifugação para um novo tubo de reacção de 1,5 mL e adicionar 50 mL de água isenta de RNase. Centrifugar a coluna durante 1 min a 8000 xg para eluir o ARN. Remover DNA residual usando um Kit de free-DNA Ambion acordo com as instruções do fabricante. Determinar a qualidade do RNA. O ARN devem ter números de integridade do RNA (NIR) acima 8. Envie fora do RNA para o sequenciamento de próxima geração.