バイオベースの産業の原料としてたばこ木とポプラの評価のための転写産物および代謝物プロファイリング

1。植物材料 M2は、プロの成長培地を含む直径30cmの鉢にタバコグラウカの植物を育てる。 日中の20〜25℃の温度と15℃の夜間温度が、温室で植物を育てる補助光政権として16時間明及び8時間の暗闇のサイクルを使用してください。 2。サンプル調製 一次代謝産物の場合： 収穫植物材料（葉およびN.アラカシの茎）、すぐに材料を凍結する。 三日間凍結乾燥して凍結した植物材料を凍結乾燥する。 金属ボールミキサーミルで凍結乾燥試料を挽く。 の2ml遠心チューブまたはガラスバイアルにアリコート微粒子接地乾燥材料。 二次代謝産物の場合： 収穫植物組織、凍結材料すぐに。 mで凍結した植物組織を挽くステンレス鋼球または乳鉢と乳棒によるixerミル。 2ミリリットルの遠心分離管（約20mgの湿重量）に分量細挽き組織。 GC-MSによる一次代謝産物のための代謝物プロファイリングのため3。抽出プロトコール 2ミリリットル中の分量のグランドドライ植物材料（葉と茎材料の20mgを10 mg）を、スクリューキャップ、丸底チューブ。 10秒間100％メタノールと渦の1400を添加する。 10秒のための内部定量標準と渦としてリビトール60μlの（H 2 O中0.2 mg / mlのストック）を追加します。 1ステンレス鋼（またはジルコニア）ボールを追加し、25 Hzで2分間ミキサーミルを有する材料を均質化する。 遠心分離11,000×gで10分間混ぜる。 ガラスバイアルに上清を移します。 クロロホルム750μLを加える。 H 2 Oを1,500μLを加え、10秒間ミックスをボルテックスする。 から150μLを転送新しい1.5ml遠心管に上相（極性相）。 スピードバックを用いたドライサンプル。これは、残留液体が存在しなくなるまでサンプルが、3〜24時間乾燥するまで減少することが肝要である。 メトキシアミン塩酸塩（ピリジン中20 mg / ml）を40μlのを追加します。 37℃で2時間水平ヒートブロックシェーカーでミックスを振る 70μlのN-メチル-Nを追加- （トリメチルシリル） -トリフルオロMSTFAミックス。 37℃で2時間のミックスを振る 11,000×gで約1分の短い遠心分離することによりカバーの滴をスピンダウン。 GC-MS分析に適したガラスバイアルに液体を移す。 LC-MSによる二次代謝物代謝物プロファイリングのため4。抽出凍土サンプルに500μLのメタノールを追加します。 70℃（千秒-1）で15分間サーモミキサーで振る。 遠心分離機のサンプル（5マイルN 20,000×g）で、1.5 ml遠心管に移し、液相。 遠心エバポレーター（スピードバック）で液相を凍結乾燥。 乾燥ペレットに100μlのシクロヘキサン、100μlのミリQ水を追加します。 室温（使用ボルテックス）で5分間サンプルを振盪する。 遠心分離機のサンプル（5分20,000 XG）。 LC-MS分析のための円錐底で、LC-MSの注射用バイアルに水相（下相）を80μlを移す。 5。データ解析 Xcalibur、MarkerLynx、Metalign 7またはXCMS 8を設定し、処理すべきデータ分析]を選択します。 表1中の化合物のクラスに応じて、ご関心の検出されたピークのテーブルを準備します。 標準化合物の共溶出によってピークを同定。 続いてのMSn分析、構造解析アルゴリズム9,10、文献秒を使用して検出されたピークに注釈を付けるurveyおよび代謝物データベース検索11,12。 6。炭化水素の抽出13 収穫されたばかりのNを沈める2〜20分間、HPLC等級）; グラウカ葉（メタノール、エタノール、クロロホルム、ヘキサン、石油エーテル（沸点40〜60℃又は60〜80℃）溶媒（〜200mg）の（5 mlである。 葉を削除し、回転蒸発により完全に溶媒を蒸発乾燥させます。 ヘキサンに再懸濁サンプル（1ミリリットル、HPLCグレード）。 ガスクロマトグラフィーおよび5973MSDにハイフン付きを使用して、GC-MS分析を実行します。以下のように動作条件はである必要があります。キャリアガスは、0.9ミリリットル分の流量でヘリウム-1 / 11ψ。 280℃でスプリットレスインジェクタとサンプル（1μL）を注入320℃まで4℃/分でランピングの前に5分間、70℃でガスクロマトグラフィーオーブンを保持67.5分の合計時間を作り、さらに10分間の最終温度を保持する。 280℃でのMSとPとのインターフェースを設定するerform 70 eVのEI +を使用して、フルスキャンモードでのMSと10〜800 Dからスキャンされた最初に自動化されたMSのデコンボリューションおよび識別システムによってクロマトグラム成分を処理し、NIST 98 MSライブラリーを用いて同定されたもの。 既知の本格的な標準に保持時間および古典断片化パターンを比較することによって、長鎖飽和アルカン炭化水素（hexacosenol、ノナコサン、トリアコンタン、octacosenol、nonacosonal、ヘントリアコン、ドトリアコタンおよびトリトリアコタン）の識別を確認してください。 定量的に決定する真正標準から構成された用量応答曲線（0.07から2.5mg）と統合されたピーク面積を比較することにより炭化水素が挙げられる。 Excelソフトウェアを使用することを意味し、平均の標準誤差（SEM）を計算します。 イソプレノイド14の7。分析セクション2で説明したように均質化を実行します。遠心管に均質化された凍結乾燥した粉末10mgを計量。 、粉末上に順次250ミリリットルのメタノールを加えて混ぜ、その後、500ミリリットルのクロロホルム（実験用試薬グレード）を追加し、ボルテックスで混ぜる。 20分間暗闇に氷上でサンプルを残す。 懸濁液に250ミリリットルのトリス – 塩酸緩衝液（100mM、pH7.5）に、または水（HPLCグレード）を追加し、ボルテックスで混和する。 水相から非極性を分離するために5分間12,000 rpmで（13523×g）で混合し遠心分離する。イソプレノイド抽出物を含む無極性クロロホルム相は下部にあります。 新しい遠心チューブに位相を転送します。 水相に、追加の500ミリリットルのクロロホルムを追加し、ボルテックスし、上記のように遠心分離することによって第二の抽出を行っています。 クロロホルム抽出物を合わせ、分析まで-20℃で蒸発し、ストアを使用して乾燥するまでのサンプルを持参。 材料を再溶解し、乾燥イソプレノイド抽出物を50mlの酢酸エチル（HPLC等級）を添加する。 C18に3ミリリットルを注入アクイティーUPLC分離モジュールを用いたカラム。顔料を分離するのに使用するグラデーションが含まれている必要があり; ：メタノール/ H 2 O（50:50）およびB：アセトニトリル/酢酸エチル（75:25）であり、初期条件は、30％（v / v）でBが70％（v / v）の100に行くであるべきである6分間にわたる％のB。 0.6ml /分の流速を使用する。 250〜600 nmのフォトダイオードアレイ（PDA）検出器を連続して溶出液を監視します。 共同クロマトグラフィーおよび信頼できる標準、ベータカロチン（プロビタミンA）、フィトエン、リコピン、ルテインとゼアキサンチンの間のスペクトルの比較でコンポーネントを特定します。 用量反応曲線から定量化を行う。 LC-MSを用いた化合物を確認してください。類似のクロマトグラフィー条件を使用しています。検出は、Q-TOF装置でポジティブモードでAPCIイオン化を使用して行われるべきである。 1.5時間、50℃で6％のKOHで抽出し、鹸化された25 mgの凍結乾燥させた材料とトコフェロールを決定するための修正を行います。 <pクラス= "jove_title"> 8。 RNAの配列のためのRNA抽出このプロトコルは、高品質のRNAを得るために、RNeasyキットでトリゾールRNA抽出を兼ね備えています。 ミキサーミルで金属球2 mlの遠心管中で凍結した植物材料100mgを挽く。 1ミリリットルトリゾールを追加します。 4℃にて12,000×gで10分間遠心分離する材料を新しい反応チューブに上清を移す。 、200μlのクロロホルムを追加するチューブを数回転倒させ、室温で3分間インキュベートする。 4℃で12,000×gで15分間のミックスを遠心分離新しい反応チューブに上の水相（約700μl）を転送します。 エタノールの約2.5容量（100％）を追加し、チューブを数回反転させ、-80℃で30分間インキュベートするキットからスピンカラムに沈殿物を含むサンプルを移動します。 8,000×gで15秒間カラムを遠心し、Fを破棄による低。 8,000 X gで15秒間スピンカラムや遠心に700μlのBuffer RW1を追加します。通る流れを捨てる。 スピンカラムに500μlのBuffer RPEを加え、8,000 X gで15秒間カラムを遠心。通る流れを捨てる。 8,000 X gでスピンカラムと2分間遠心分離機に500μlのBuffer RPEを追加します。 新しい1.5 ml反応チューブにスピンカラムを配置し、50μlのRNaseフリー水を追加します。 RNAを溶出するために8000×gで1分間カラムを遠心。 メーカーの指示に従ってのAmbionのDNA-フリーキットを使用して残存DNAを除去します。 RNAの品質を決定する。 RNAは8上記のRNAの完全性番号（RIN）を有するべきである。 次世代シーケンシングのためのRNAを送る。