Transcription et profilage des métabolites pour l'évaluation des arbres tabac et le peuplier comme matière première pour l'industrie de la bioéconomie

1. Matériel végétal Faire pousser des plantes Nicotiana glauca dans 30 pots cm de diamètre contenant un milieu de culture M2 professionnel. Cultiver des plantes dans une serre, avec une température diurne de 20 à 25 ° C et température nocturne de 15 ° C. Utiliser une lampe de 16 h et le cycle de l'obscurité de 8 heures que le régime de lumière supplémentaire. 2. Préparation de l'échantillon Pour métabolites primaires: matières végétales de récolte (feuilles et tiges de N. glauca) et le matériel de gel immédiatement. Lyophiliser matériaux végétaux surgelés par lyophilisation pendant trois jours. Broyer les échantillons lyophilisés par vibro-broyeur avec des boules métalliques. Aliquote amende sol matériaux secs dans un tube de centrifugeuse de 2 ml ou un flacon de verre. Pour métabolites secondaires: tissus végétaux de récolte et de matériel de gel immédiatement. Broyer les tissus végétaux congelés par mmoulin à ixer avec bille en acier inoxydable ou en mortier et un pilon. Aliquotes tissus sol fines dans 2 ml tube de centrifugation (environ 20 mg de poids humide). 3. Protocole d'Extraction de profilage des métabolites de métabolites primaires par GC-MS matériel végétal sec au sol aliquote (10 mg de feuilles et de 20 mg de matières souches) dans 2 ml, bouchon à vis, tubes à fond rond. Ajouter 1400 pi de methanol à 100% et vortex pendant 10 s. Ajouter 60 ul de ribitol (0,2 mg / ml d'actions en H 2 O) comme une norme quantitative interne et vortex pendant 10 secondes. Ajouter un acier inoxydable (ou zircone) balle et d'homogénéiser les matériaux avec un vibro-broyeur pendant 2 min à 25 Hz. Centrifuger le mélange pendant 10 min à 11 000 x g. Transférer le surnageant dans un flacon en verre. Ajouter 750 ul de chloroforme. Ajouter 1500 pi de H 2 O et vortex le mélange pendant 10 secondes. Transférer 150 ul de laphase supérieure (phase polaire) dans un nouveau tube de 1,5 ml de la centrifugeuse. Les échantillons secs à l'aide d'un aspirateur de vitesse. Il est impératif que les échantillons sont réduits à siccité pour entre 3 et 24 heures jusqu'à ce qu'aucun liquide résiduel est présent. Ajouter 40 pi de chlorhydrate de méthoxyamine (20 mg / ml dans de la pyridine). Agiter le mélange dans un shaker horizontale du bloc de la chaleur pendant 2 heures à 37 ° C. Ajouter 70 ul de N-méthyl-N – (triméthylsilyl)-trifluoroacétamide MSTFA mélange. Agiter le mélange pendant 2 heures à 37 ° C. Isoler les gouttes sur le couvercle par une courte centrifugation ~ 1 min à 11 000 x g. Transférer le liquide dans des flacons en verre appropriés pour l'analyse GC-MS. 4. Extraction de profilage des métabolites de métabolites secondaires par LC-MS Ajouter 500 ul de methanol pour les échantillons de sol gelé. Agiter avec une thermomixer pendant 15 min à 70 ° C (1 000 sec -1). Centrifuger les échantillons (5 kmn, 20 000 x g) et la phase liquide transféré dans un tube de 1,5 ml de la centrifugeuse. Lyophiliser la phase liquide dans un évaporateur centrifuge (speedvac). Ajouter 100 pi de cyclohexane et 100 pi d'eau milliQ au culot sec. Agiter les échantillons pendant 5 min à température ambiante (utilisation de vortex). Centrifuger les échantillons (5 min, 20 000 xg). Transférer 80 ul de la phase aqueuse (phase inférieure) pour flacons d'injection LC-MS à fond conique pour l'analyse LC-MS. 5. Analyse des données Configurez Xcalibur, MarkerLynx, Metalign 7 ou 8 XCMS et sélectionnez l'analyse de données à traiter. Préparer un tableau de pics détectés de votre intérêt conformément à la classe de composés dans le tableau 1. Identifier les pics par co-élution de composés standard. Annoter la suite pics détectés en utilisant une analyse MSN, algorithmes de caractérisation structurale 9,10, la littérature sNQUETE et métabolite recherche 11,12 de base de données. 6. Hydrocarbures 13 Extraction Immerger N. fraîchement récoltés feuilles glauca (~ 200 mg) dans un solvant (methanol, l'éthanol, le chloroforme, l'hexane ou l'éther de pétrole (point de 40 à 60 ° C ou de 60 à 80 ° C point d'ébullition) (5 ml; qualité HPLC) pour 2 à 20 min. Enlevez les feuilles et sécher complètement les solvants par évaporation rotative. Remettre en suspension les échantillons dans de l'hexane (1 ml; qualité HPLC). Effectuer une analyse GC-MS en utilisant la chromatographie de gaz et un trait d'union à un 5973MSD. Les conditions d'exploitation devraient être les suivants; gaz vecteur, l'hélium avec un débit de 0,9 ml min -1 / 11 psi d'écoulement. Injecter des échantillons (1 pi) avec un injecteur sans division à 280 ° C. Maintenir le four de chromatographie en phase gazeuse à 70 ° C pendant 5 min avant de rampe à 4 ° C / min jusqu'à 320 ° C. Maintenir la température finale pendant 10 minutes supplémentaires, ce qui en un temps total de 67,5 min. Régler l'interface avec la MS à 280 ° C et perform MS en mode analyse complète en utilisant 70 eV assurance-emploi + et numérisée de 10 à 800 D. Traiter d'abord les composants de chromatogramme par déconvolution de MS système automatisé d'identification, et ceux qui sont identifiés à l'aide de la bibliothèque MS NIST 98. Confirmer l'identification d'hydrocarbures saturés à chaîne longue (alcanes hexacosenol, nonacosane, triacontane, octacosenol, nonacosonal, hentriacontane, dotriacontane et tritriacontane) en comparant les temps de rétention et des motifs de fragmentation classiques aux normes authentiques connus. Déterminer hydrocarbures quantitativement en comparant les aires des pics intégrés avec des courbes dose-réponse (de 0,07 à 2,5 mg), construits à partir des normes authentiques. Calculer les moyens et l'erreur type de la moyenne (SEM) en utilisant le logiciel Excel. 7. Analyse des isoprénoïdes 14 Effectuer homogénéisation tel que décrit dans la section 2. Peser 10 mg de poudre lyophilisée homogénéisé dans un tube de centrifugeuse. Ajouter successivement 250 ml de méthanol sur la poudre, mélanger, puis ajouter 500 ml de chloroforme (réactif de laboratoire de grade), et mélanger au vortex. Laisser les échantillons sur la glace dans l'obscurité pendant 20 min. Ajouter 250 ml de tampon Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) ou de l'eau (qualité HPLC) à la suspension et mélanger au vortex. Centrifuger le mélange à 12 000 tours par minute (13 523 x g) pendant 5 minutes pour séparer le non-polaire à partir de phases aqueuses. La phase chloroformique contenant des extraits non polaires est isoprénoïdes en bas. Transférer la phase dans un nouveau tube de centrifugation. Ajouter un montant supplémentaire de 500 ml de chloroforme à la phase aqueuse, et procéder à une seconde extraction par vortex et centrifugation comme décrit ci-dessus. On combine les extraits de chloroforme et de traduire les échantillons à sec à l'aide de l'évaporateur et de conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse. Ajouter de l'acétate d'éthyle de 50 ml (qualité HPLC) à l'extrait séché isoprénoïde pour redissoudre la matière. Injecter 3 ml sur une C18colonne en utilisant un module de séparation Acquity UPLC. Le gradient utilisé pour séparer les pigments devrait comprendre; A: un mélange méthanol / H 2 0 (50:50) et B: acétate d'acétonitrile / acétate d'éthyle (75:25), et les conditions initiales soient A 30% (v / v) et B à 70% (v / v) allant de 100 % B de plus de 6 min. Utilisez un taux de 0,6 ml / min. Surveiller continuellement l'éluat avec une matrice de diodes d'images (PDA) du détecteur de 250 à 600 nm. Identifier les composants par co-chromatographie et comparaisons spectrales entre les normes authentiques, bêta-carotène (provitamine A), phytoène, le lycopène, la lutéine et la zéaxanthine. Effectuer la quantification à partir des courbes dose-réponse. Confirmez composés par LC-MS; utiliser des conditions chromatographiques similaires. Détection doit être effectuée à l'aide APCI ionisation en mode positif avec un instrument Q-Tof. Effectuer des modifications pour la détermination de tocophérol avec la matière séchée 25 mg de gel qui ont été extraites et saponification dans 6% de KOH à 50 ° C pendant 1,5 h. <pclass = "jove_title"> 8. Extraction d'ARN de l'ARN Seq Ce protocole combine l'extraction d'ARN Trizol avec un kit RNeasy pour obtenir l'ARN de haute qualité. Broyer 100 mg de matière végétale congelée dans 2 ml des tubes de centrifugation avec une boule de métal d'un broyeur mélangeur. Ajouter 1 ml Trizol. Centrifuger le matériau pendant 10 min à 12 000 xg à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de réaction. Ajouter 200 ul de chloroforme, inverser le tube plusieurs fois, et laisser incuber 3 min à température ambiante. Centrifuger le mélange pendant 15 min à 12 000 g à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse supérieure (environ 700 ul d') dans un nouveau tube de réaction. Ajouter environ 2,5 volumes d'éthanol (100%), inverser le tube plusieurs fois, et incuber pendant 30 min à -80 ° C. Déplacer l'échantillon, y compris tout précipité de la colonne de centrifugation de kit. Centrifuger la colonne pendant 15 secondes à 8000 xg, et jeter le fbas à travers. Ajouter 700 ul de tampon RW1 à la colonne et centrifuger pendant 15 s à 8000 x g. Jeter l'effluent à travers. Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne et centrifuger la colonne pendant 15 secondes à 8000 x g. Jeter l'effluent à travers. Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne et centrifuger pendant 2 min à 8000 x g. Placer la colonne spin dans un nouveau tube de 1,5 ml de réaction et ajouter 50 l'eau sans RNase-pi. Centrifuger la colonne pendant 1 min à 8000 x g pour éluer l'ARN. Éliminer l'ADN résiduel en utilisant un kit gratuit de l'ADN-Ambion selon les instructions du fabricant. Déterminer la qualité de l'ARN. L'ARN doit avoir des numéros de l'intégrité de l'ARN (RIN) ci-dessus 8. Envoyer l'ARN pour le séquençage de prochaine génération.