والاستفادة من البلعوم الإدارة داخل القصبة الهوائية والقصبات PAMP الغسل لتقييم استجابة المضيف المناعية في الفئران
Summary
استجابة المضيف المناعية للإصابة الممرض هو عملية تنظيم محكم. الاستفادة من وجود عديد السكاريد الشحمي الرئة نموذج التعرض في الفئران، وأنه من الممكن إجراء تقييمات عالية الدقة من الآليات المعقدة المرتبطة المرضية المرض.
Abstract
استجابة المضيف المناعي لمسببات الأمراض هو عملية بيولوجية معقدة. غالبية العاملين في الدراسات المجراة كلاسيكي لتوصيف التفاعلات المضيف الممرض الاستفادة من الحقن داخل الصفاق من البكتيريا أو الممرض حدد المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) في الفئران. في حين أن هذه التقنيات قد أسفرت عن البيانات الهائلة المرتبطة البيولوجيا المرضية الأمراض المعدية، ونماذج حقن داخل الصفاق ليست دائما ملائمة للدراسات التفاعل المضيف الممرض في الرئة. استخدام نموذج التهاب الرئة الحادة في الفئران، فمن الممكن إجراء تحليل عالية الدقة للمضيف الاستجابة المناعية الفطرية باستخدام عديد السكاريد الشحمي (LPS). هنا، نحن تصف الأساليب لإدارة LPS استخدام غير الجراحية الإدارة داخل القصبة الهوائية والبلعوم، ورصد المعلمات السريرية المرتبطة المرضية المرض، والاستفادة من السائل غسل القصبات لتقييم الاستجابة المناعية المضيف. التقنيات التي تم وصفهاقابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة لمجموعة متنوعة من PAMPs ومسببات الأمراض. وبالمثل، مع تعديلات طفيفة، وهذه التقنيات يمكن أن تطبق أيضا في دراسات تقييم التهاب الشعب الهوائية التحسسي والتطبيقات الدوائية.
Introduction
الالتهابات الرئوية المرتبطة بالأنواع البكتيريا المسببة للأمراض هي سبب شائع للمراضة والوفيات في العالم. وتحديد الآليات التي تدفع استجابة المضيف المناعية لهذه الجراثيم تعزيز تنمية استراتيجيات الوقاية الرواية والعوامل العلاجية التي من شأنها أن تخفف من وقع هذه الالتهابات. الهدف العام للبروتوكول الموصوفة هنا هو توفير للمستخدم مع طريقة مرنة لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة للإصابة الممرض باستخدام الممرض المرتبطة نمط الجزيئية (PAMP) كبديل للبكتيريا حية. وقد ركزت معظم الدراسات السابقة تقييم الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة للبكتيريا على نماذج البريتوني بسبب السهولة النسبية التنفيذ. في حين أن هذه النماذج مفيدة للغاية وأدت إلى تقدم كبير في مجال التفاعلات المضيف الممرض والتهاب النظامية، والبيانات الناتجة من هذه النماذج ليست دائما ملائمة للدراسات involviنانوغرام الجهاز التنفسي. هنا، يقترح نموذجا الرئوي التهاب الرئة الحاد كما توسع عملية وذات الصلة سريريا من النماذج الكلاسيكية حقن داخل الصفاق (IP). تقنية المقترح يسمح للتقييم المحلي للاستجابة المناعية الفطرية في نظام الجهاز نموذج محدد.
وقد صممت الطرق الموضحة هنا لتوفير تقنية بسيطة وقوية للسماح للمستخدمين لتقييم الاستجابة المناعية للمضيف LPS، وهو PAMP المشتركة. وتستند طرق على داخل الرغامى (ذلك) من تقطير LPS، والذي يؤدي الى الاستجابة المناعية الفطرية قوية في الرئتين من الفئران ويقلد الكثير من الميزات الفيزيولوجية المرضية التي لوحظت في المرضى من البشر الذين يعانون من التهابات الجهاز التنفسي وإصابة الرئة الحادة 1. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يتيح للمستخدم لتقييم الاستجابة المناعية المضيف دون عوامل خارجية ومخاوف تتعلق بالسلامة المرتبطة بإجراء الدراسات المجراةاستخدام البكتيريا الحية. وبالمثل، فإن الفم والبلعوم الطريق الادارة انها التعرض الموصوفة في هذا البروتوكول لديه مزايا هامة على التقنيات المستخدمة عادة أخرى، بما في ذلك الأنف (في) الإدارة والإدارة أنه الجراحية. على سبيل المثال، الادارة انها البلعوم يسمح dosaging دقيقة نسبيا وترسب الرئة مقارنة في الإدارة، الذي يعاني عادة من زيادة تقلب ترسب الرئة بسبب فقدان وكلاء في تجويف الأنف والجيوب 2-4. الطريق الادارة انها تلتف هذه التجاويف ويتيح الوصول مباشرة إلى القصبة الهوائية والشعب الهوائية. وبالمثل، فإن النهج الذي الجراحية هو أسلوب الإدارة بشكل ملحوظ أكثر المهووسين ويتطلب التدريب المكثف لإتقان. وتشمل البروتوكولات وصفها هنا أيضا وصفا لتقنيات مشتركة وعلامات بديلة تستخدم لتقييم تطور التهاب وينتهي بروتوكول يصف التقنيات المناسبة لإعداد لوخ ع لتقييم التشريح المرضي. وتركز هذه البروتوكولات على التقليل من عدد من الفئران المطلوبة لكل دراسة من خلال تعظيم البيانات المتولدة من كل حيوان على حدة.
البروتوكولات وصفها مرنة للغاية ويمكن تعديلها بسهولة لتقييم PAMPs مجموعة متنوعة والأضرار المرتبطة أنماط الجزيئية (DAMPs). علاوة على ذلك، مع بضعة تعديلات إضافية، هذه البروتوكولات يمكن أن تطبق أيضا على دراسات تقييم مجرى الهواء حساسية تطور المرض أو التفاعلات المضيف الممرض مع البكتيريا الحية أو الفيروسات أو الفطريات 5-10.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية لتقييم بنجاح استجابة المضيف المناعية في الماوس الرئتين هي كما يلي: 1) اختيار سلالة الفأر المناسبة والجنس لنموذج يجري تقييمها؛ 2) تحسين تسليم PAMP إلى الرئتين؛ 3) جمع بشكل صحيح ومعالجة BALF؛ و4) إصلاح بشكل صحيح وإعداد الرئتين لتقييم التشريحية المرضية. </p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر كلية VA-MD الإقليمي للطب البيطري لتوفير الأساسية والدعم التقني لهذا المشروع. ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح التطوير المهني (K01DK092355).
Materials
| C57Bl/6J | The Jackson Laboratory | Stock 000664 |
| Compact Scale | Ohaus Scale Corporation | 71142845 |
| Small Animal Rectal Thermometer | Braintree Scientific | TH 5 |
| Rectal Probe for Rodents | Braintree Scientific | RET 3 |
| Ear Punch | Braintree Scientific | EP-S 901 |
| Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4 | InvivoGen | LPS-EB |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 |
| Isoflurane | Baxter | 40032609 |
| Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand | ICAP Manufacturing | n/a |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 100 |
| Scissors (blunt/sharp) | Fisher Scientific | 13-806-2 |
| forceps (straight) | Fisher Scientific | 22-327-379 |
| forceps (45º, curved) | Fisher Scientific | 10-275 |
| Scissors (blunt/blunt) | Fisher Scientific | 08-940 |
| Pipette (200 µl Capacity) | Gilson | F123601 |
| Ethanol | Sigma | 459844 |
| 1 ml Syringe | BD Medical | 301025 |
| 10 ml Syringe | BD Medical | 301604 |
| 27 G x 0.5 in. needle | BD Medical | 305109 |
| Refrigerated Microcentrifuge | Fisher Scientific | 13-100-676 |
| 1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter | Harvard Apparatus | 732836 |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-076 |
| 4-0 Silk Braided Surgical Suture | Ethicon | A183 |
| Luer to Tube Connector Kits | Harvard Apparatus | 721406 |
| Luer Stopcock Kit | Harvard Apparatus | 721664 |
| Tygon formula E-3603 laboratory tubing | Sigma | R-3603 |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L |
| Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 559603 |
| Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 550950 |
| Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit | BD Biosciences | 560478 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 3520 |
| Hemacytometer Cover Glasses | Thermo Scientific | 22-021-801 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV3008401 |
| Cytology Funel Clips | Fisher Scientific | 10-357 |
| Cytology Funels | Fisher Scientific | 10-354 |
| Filter Cards | Fisher Scientific | 22-030-410 |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 |
| Cover Glasses | Fisher Scientific | 12-540A |
| Cytospin Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 |
| Diff Quick Staining Kit | Fisher Scientific | 47733150 |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-500 |
References
- Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).
- Egger, C., et al. Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology. PloS one. 8, (2013).
- Rayamajhi, M., et al. Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. , (2011).
- Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).
- Allen, I. C., et al. Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice. J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).
- Allen, I. C., et al. Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis. PloS one. , (2013).
- Allen, I. C., et al. Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).
- Kebaier, C., et al. Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome. J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).
- Roberts, R. A., et al. Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles. PloS one. 8, (2013).
- Willingham, S. B., et al. NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways. J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).
- Kline, J. N., et al. Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide. Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).
- Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).
