Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

Der Prozess der Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße zu bilden, auffindbar sind, ist sehr komplex und wird durch verschiedene endogene Faktoren, die verschiedene Schritte des Schiffes Keimen und Morphogenese Steuerung geregelt. Angiogenese aufgrund einer Verschiebung im Gleichgewicht zwischen pro-und anti-angiogene Faktoren, die das Gleichgewicht hält normalerweise das Gefßsystem in einem Ruhezustand ausgelöst. Angiogenese beim Erwachsenen kommt in bestimmten physiologischen Bedingungen wie bei der weiblichen ovariellen Zyklus oder Reparaturprozessen wie der Wundheilung und Geweberegeneration. Es ist jedoch auch ein Markenzeichen von mehreren Krankheiten, einschließlich Malignitäten, Autoimmunerkrankungen und entzündlichen Erkrankungen. Die Beteiligung von Angiogenese in diesen physiologischen und pathologischen Bedingungen ist es ein wichtiges Thema für Forschung und ein attraktives Ziel für die Therapie.

Aufgrund der Komplexität der Angiogenese und der Beteiligung mehrerer ceLLS und Faktoren in dem Verfahren, einschließlich Endothelzellen, Perizyten, zirkulierenden Zellen und Stromazellen in vitro-Modellen beschränkt bleiben und die einzigartige Mikroumgebung in vivo nicht zu wiederholen. Der Haupt in-vitro-Assays der Angiogenese sind weitgehend auf die Beobachtung direkte Auswirkungen auf Endothelzellen und Messen bestimmter Schritte in angiogenen Prozess unter kontrollierten Bedingungen konzentriert. Diese Assays umfassen die Quantifizierung der Endothelzellproliferation ^1, Migration ^2, Netzwerkbildung ^{3, 4} und Schlauchbildung Keime aus Sphäroiden. ⁵ Ex-vivo-Modellen, im Gegensatz zu den in vitro diejenigen, sind komplexer und enthalten mehrere Gewebezelltypen, wobei ein Beispiel die Aorten-Ring-Test ^6. Dennoch, wie andere Systeme, kann es nicht den Beitrag von zirkulierenden Zellen und natürliche Stroma von Endothelzellen zu erfassen, wie in vivo existiert. VersucheAngiogenese unter Strömungs untersuchen, um die in vivo-Situation unter Verwendung mikrofluidischer Systeme ⁷ durchgeführt wird, aber auch diese Assays nachahmen, obwohl viel verbessert, sind noch nicht für alle in vivo vorhandenen Kammern entfallen.

Aufgrund der Einschränkungen der in vitro und ex vivo-Angiogenesemodellen in vivo Modellen bleibt das zuverlässigere Auswahl für Angiogenese-Studien. Beispiele für diese Modelle sind die Implantation von transparenten Kammern, "Fenster", die die Visualisierung von wachsenden Blutgefäße unter dem Mikroskop ⁸ zu ermöglichen, injizierbare subkutane Implantate wie Matrigel und Gefäßbildung in normalen Geweben wie Mausohr und dem Huhn Chorioallantoismembran (CAM ). Allerdings ist eine der akzeptablen und quantitative in vivo Angiogenese-Modellen die hier beschriebene Hornhautmikrotaschen-Assay Neovaskularisierung, welche das natürlich avaskulären nutztHornhaut als "Bildschirm" zu visualisieren und zu beurteilen, neue angiogene Wachstums ^9.

Hier beschreiben wir die Hornhaut-Mikrotaschen-Assay in Mäusen entwickelt. Zunächst wurde das Modell verwendet werden, um unspezifische Reize angiogenen in Kaninchen-Hornhaut messen. Dies wurde durch die Einführung von Tumorstücke in das Kammerwasser von der Vorderkammer des Auges des Kaninchens durchgeführt und gemessen Tumor-induzierte Neovaskularisierung ^11.

Allerdings wurde der Test später entwickelt, um Effekte von spezifischen Wachstumsfaktoren zu untersuchen ^10, besser zu spezifizieren und zu standardisieren, die angiogene Wirkung. Um den Wachstumsfaktor in das Auge zu lösen, wurden Pellets mit langsamer Freisetzung, die bekannte Mengen von angiogenen Wachstumsfaktoren anstelle von Geweben verwendet. Die Verfügbarkeit von gereinigten rekombinanten Proteine ​​angiogenen wie bFGF oder VEGF aktiviert ihre Verwendung als spezifische Ziele der Angiogenese modulaters ^12. Zunächst wurde der Assayweitgehend in Kaninchen, die einfacher, mit aufgrund ihrer Größe, aber später wurde das Modell in Mäuse setzten Werk verwendet werden; ein kleiner und kostengünstiger Tiermodell. Der Wechsel von Kaninchen, Mäuse vorgesehen einen wichtigen Vorteil in der Lage zu genetisch manipulierten Tieren zu verwenden, wodurch eine neue Ära der Erforschung der genetischen Komponenten beeinflussen die Angiogenese ¹³ entsteht. Neben der Nutzung von akzeptabler Hornhaut-Test bei der Untersuchung der Angiogenese, andere biologische Prozesse können ebenfalls unter Verwendung von modifizierten Assays untersucht. So wurden beispielsweise Studien von Lymphangiogenese möglich durch die Implantation von niedrig dosiertem bFGF-Pellets, die die Visualisierung von Lymphgefäßen durch spezifische molekulare Marker ¹⁴ erlaubt werden. Darüber hinaus hat dieser Test ein Mittel, um die Wirkung der Strahlung auf die Angiogenese zu bewerten ¹⁵ vorgesehen.

In Summe ist die Hornhaut-Mikro Angiogenese-Assay eine quantitative, reproducible, flexible Beurteilung der Angiogenese in vivo. Ein großer Vorteil dieses Tests besteht darin, dass die Messung der Hintergrundgefäße unnötig, weil die Behälter wachsen auf einem natürlich avaskulären Gewebe. Wir beschreiben hier das Protokoll dieses Tests in Details und verschiedenen Szenarien, die auftreten können, zu diskutieren. Der Test besteht aus 3 diskrete Segmente. Hier werden wir die Herstellung von Wachstumsfaktor-inclusive-Pellets, die spätere chirurgische Implantation und schließlich die Methode verwendet, um die daraus resultierenden neovaskulären Wachstum zu quantifizieren.