Лазерно-индуцированное Разбивка спектроскопия: новый подход по картированию и количественной наночастиц в ткани органа
Summary
Лазер-пробой спектроскопия выполняется на тонком органа и ткани опухоли успешно обнаружил природные элементы и искусственно вводят гадолиний (GD), выпущенные от наночастиц Б-г на базе. Изображения химических элементов достиг разрешение 100 мкм и количественного чувствительности к югу мм. Совместимость установки со стандартным оптической микроскопии подчеркивает его потенциал, чтобы обеспечить несколько изображений одного и того же биологической ткани.
Abstract
Излучение спектроскопия лазерной плазмы был применен к элементного анализа биологических образцов. Лазер-пробой спектроскопии (LIBS) выполняется на тонких срезов грызунов тканей: почки и опухолевых, позволяет обнаружение неорганических элементов, таких как (I) Na, Ca, Cu, Mg, P, и Fe, естественным образом присутствуют в организме и (II) Si и Б-г, обнаружен после инъекции наночастиц гадолиния основе. Животные были умерщвлены 1 до 24 часов после внутривенного введения частиц. Двумерная сканирование образца, выполняется с использованием моторизованного микрометрической 3D-сцену, позволило инфракрасный лазерный луч, чтобы исследовать поверхность с пространственным разрешением менее 100 μ м. Количественный химический изображения элемента Gd внутри органа были получены с чувствительностью к югу мм. LIBS предлагает простой и надежный метод для изучения распределения неорганических материалов без какого-либо специального labeliнг. Кроме того, совместимость установки со стандартным оптической микроскопии подчеркивает его потенциал, чтобы обеспечить несколько изображений одного и того же биологической ткани с различными типами ответ: элементный, молекулярных или клеточных.
Introduction
Широкое развитие наночастиц для биологических применений призвал параллельный улучшение аналитических методов для их количественного и обработки изображений в биологических образцах. Обычно обнаружение и отображение наночастиц в органах сделаны флуоресценции или конфокальной микроскопии. К сожалению, эти методы требуют маркировки наночастиц с помощью ближней инфракрасной краски, который может модифицировать биораспределение наночастиц, особенно при очень малых наночастиц из-за его гидрофобных свойств. Обнаружение меченых наночастиц, и особенно очень маленьких наночастиц (размер <10 нм), может, таким образом, препятствовать их биораспределение на всей шкале тела, но и на ткани и клеточных уровней. Разработка новых устройств, способных обнаружить наночастицы без маркировки предлагает новые возможности для изучения их поведения и кинетики. Кроме того, роль микроэлементов, таких как железо и медь в головном мозге болезниг нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера 1, Menkes 2,3, или Уилсон 4 предложить интерес для изучения и локализовать эти элементы в тканях.
Различные методы были использованы для обеспечения элементарного отображение или микроанализа различных материалов. В их обзоре, опубликованном в 2006 году, Р. Lobinski др.. Представил обзор имеющихся стандартных методов элементного микроанализа в биологической среде, один из самых сложных условиях для аналитических наук 5. Электронный микрозонд, который состоит из энергии дисперсионного рентгеновского микроанализа в просвечивающем электронном микроскопе, могут быть применены к многочисленных исследований, если концентрация элемент является достаточным (> 100-1000 мкг / г). Для достижения более низких пределов обнаружения, были использованы следующие методы:
- ионного пучка микрозондовый использованием частиц индуцированного рентгеновского излучения μ-PIXE (1-10 мкг / г) 6
- синного излучения микроанализ μ-SXRF (0,1-1 мкг / г) 7
- вторичная ионная масс-спектрометрия SIMS (0,1 мкг / г) 8
- лазерная абляция индуктивно связанной масс-спектрометрии LA-ICP-MS (до 0,01 мкг / г) 9,10
Вышеупомянутые методы обеспечивают микрометрическое разрешение, как показано в таблице 1, извлеченного из Lobinski соавт.
3D-реконструкция серийных 2D исследований также может быть предложен для реконструкции более глубоких тканей 11. Тем не менее, все устройства и системы требуют наличия как квалифицированных специалистов, умеренные до очень дорогого оборудования и продолжительный эксперименты (как правило, более чем на 4 ч в течение 100 мкм х 100 мкм для μ-SXRF и 10 мм х 10 мм для LA-ICP-MS ) 12. В целом, эти требования делают элементный микроанализ очень ограничивающая и несовместимы с обычными системами оптических изображений,флуоресцентной микроскопии или нелинейная микроскопии. Еще один момент, что мы можем упомянуть здесь является то, что количественное возможность измерения по-прежнему довольно ограничен и зависит от наличия соответствующих матрице лабораторных стандартов. Дальнейшее обобщение применение элементарного микроанализа в отрасли процессов, геологии, биологии и других областях применения будет генерировать значительные концептуальные и технологические прорывы.
Целью настоящего рукописи является создание решения для количественного элементного отображения (или элементного микроанализа) в биологических тканей с настольной аппаратуры полностью совместимы с традиционной оптической микроскопии. Наш подход основан на лазерной искровой спектроскопии (LIBS технологии). В LIBS, лазерный импульс сосредоточен на выборке из интереса, чтобы создать разбивку и искру материала. Атомное излучение в плазме затем анализируют с помощью спектрометра и элементарныхконцентрации ментальных могут быть получены с поверочные выполненных заранее 13,14. Преимущества LIBS включают чувствительность (мкг / г для почти всех элементов), компактность, очень простой пробоподготовки, отсутствие контакта с образцом, мгновенной реакции и точно локализованной (микро) поверхности анализа. Однако, применение химических ткань изображений остается сложной, поскольку лазерной абляции ткани должны быть точно контролироваться, чтобы выполнить карты с высоким пространственным разрешением вместе с чувствительностью в мкг / г диапазоне 15,16.
При таком решении, присоединением индикаторов или маркировки агентов не требуется, что позволяет обнаруживать неорганические элементы непосредственно в их родной среде в биологических тканях. LIBS инструмент, разработанный в нашей лаборатории предлагает текущее разрешение, ниже 100 мкм по оценкам, чувствительности для Б-га ниже 35 мкг / г, что эквивалентно 0,1 мм 16, что позволяетотображение больших образцов (> 1 см 2) в течение 30 мин. Кроме того, домашнее программное обеспечение облегчает приобретение и эксплуатацию данных. Этот инструмент используется для обнаружения, карту, и количественно тканевое распределение гадолиния (Gd) на основе наночастиц 17 – 18 в почках и образцов опухоли из мелких животных, 1 до 24 часов после внутривенного введения частиц (размер <5 нм) . Неорганические элементы, которые по своей сути, содержащиеся в биологической ткани, такие как Fe, Ca, Na, и Р, были также обнаружены и в образ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Применительно к биологическим образцом, этот метод позволяет химический изображений, т. е. отображение и количественного, Б-га и Si из введенных наночастиц Б-г на базе в различных органах. Из основных критических настроек, контроль лазерных свойств (длин волн, энергии импульса, фоку?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность финансовую поддержку по Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
References
- Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
- Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
- Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes’ disease. Lancet. 1, 613 (1973).
- Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
- Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
- Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
- Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
- Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
- Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
- Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
- Pornwilard, M. -. M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
- Cremers, D. A., Radziemski, L. J. . Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , (2006).
- Miziolek, A. W., Palleschi, V. . Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
- Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
- Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
- Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).
