신생아 설치류의 복부 두개골에 개두를 확인하는 방법
Summary
수술 방법은 신생아 쥐의 복부 두개골을 노출 설명되어 있습니다. 이 방법을 사용하면 마취 새끼 뇌간 급성 전기 생리학 및 이광자 현미경 실험을 수행하기 개두술을 열 수있다.
Abstract
생체 실험을위한 개두술의 사용은 성인의 포유 동물 뇌의 개발 기간 동안 다양한 세포 과정의 역학을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다. 대부분의 생체 방법은 등쪽에있는 뇌 영역을 연구하는 개두술을 사용하지만, 이러한 복부 측면에있는 뇌교, 같은 뇌간 영역은 상대적으로 understudied 아르 남아있다. 이 프로토콜의 주요 목표는 그들이 전기 생리학 및 촬상 방법을 사용하여 생체 내에서 연구 될 수 있도록 복부 뇌간 구조에 대한 액세스를 용이하게하는 것이다. 이 방법은 수 구조 장거리 축삭의 변화, 하나의 전기 활동의 패턴과 세포의 앙상블, 그리고 신생아 동물의 혈액 뇌 장벽의 투과성의 변화를 연구. 이 프로토콜은 신생아 래트의 청각 뇌간을 연구하기 위해 주로 사용되었지만, 그것은 쉽게 그러한 신생아 생쥐, 성숙한 로덴 같은 다른 설치류의 연구에 적용 할 수있다TS 및 기타 뇌간 지역.
Introduction
형광 이미징 및 전기 생리학 기법과 조합 개두의 사용은 허용 모니터링 혈류량, 혈액 뇌 장벽의 투과성 및 살아있는 동물 1-3의 뉴런 및 신경교 세포의 활성을 측정. 여러 연구소는 건강과 질병 상태에서 뇌 생리학에 대한 통찰력을 제공하기 위해이 방법을 사용했지만, 격차는 이러한 프로세스 개발하는 동안 발생하는 방법에 대한 우리의 이해에 남아 있습니다. 또한, 대부분의 연구는 다양한 생리 학적 역할과 복부 뇌간 구조 생체 방법을 사용하여 주로 연구되고있다 있도록, 쉽게 두개골의 등면에서 액세스 할 수있는 뇌 영역에 초점을 맞추고있다.
이 프로토콜의 주요 목표는 설치류의 복부 두개골 개두술을 개방하기위한 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 같은 감각 신경 생리학의 RECO에 대한 개와 고양이와 같은 큰 포유 동물에서 수행 고전적인 연구에서 적응했다청각 뇌간 4-7 rdings. 이 프로토콜에서는 그러나, 신생아 동물의 절차를 수행하는 새로운 도전이있다. 혈관의 랜드 마크를 사용하여,이 적응 프로토콜은 신생아 쥐, 성인 마우스 및 하부 올리브 8-11 (그림 1)과 같은 다른 뇌간 영역의 청각 뇌간을 연구하기 위해 이전에 사용되었습니다.
복부 뇌간 핵을 연구하는 기존의 방법에 비해 복부 개두술의 주요 장점은 살아있는 동물에 대한 관심의 구조에 대한 직접 액세스를 제공하는 것입니다. 예를 들어, 우수한 olivary 착체의 청각 세포는 프로브의 표적 위치 및 촬상 깊이는 0.5 mm로 제한 될 수있는 이광자 촬상 방식을 사용하기위한 중요한 뇌 표면으로부터 마이크로 미터의 수십를 지역화 빛 조직의 산란 및 흡수. 복부 개두술은 뭐, 상대적으로 그대로 신경 연결과 준비를 제공합니다무형 문화 유산은 급성 및 Organotypic 슬라이스 준비 12에서 중단됩니다. 생체 내 신경 생리학 실험 13을 위해 다른 프로토콜과 달리 복부 접근법은 다중 전극 기록 및 셀룰러 앙상블에 대한 정보를 제공하는 촬상 방법과 조합 될 수있다 (6 및도 7). 마지막으로,이 프로토콜과 결합하여 형광 표지 된 용질은 용질 혈액 뇌 장벽의 투과성의 변화 (도 13)를 측정하기 위해 혈관에 주입 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시간이 중요합니다. 경험이 풍부한 연구원 (1-3 단계) 1 시간이 프로토콜을 수행 할 수 있어야한다. 여러 단계에 명시된 시간은 전문 지식을 높은 수준으로 매체를 가정합니다. 환기가 컨트롤이 동물의 질식과 사망을 초래할 수 있기 때문에 적절하고 적시에 기관 절개 및 삽관 법은 중요하다. 실수는 동물의 억제되지 않는 출혈과 사망을 초래할 수 있기 때문에 근육과 지방 조직의주의 정리도 매우 중요합니다. 캐 뉼러 삽입 경동맥를 준비 할 때 마찬가지로, 하나는 실 매듭이 느슨해지면 억제되지 않는 출혈이 일어날 것입니다, 조심스럽게 동맥을 강화하고 잘라해야합니다. 마지막으로, 뇌 수술은 혈관의 관광 명소를 방해하지 않고, 신중하게해야한다. 외장 수막 층 (경질)의 부주의 제거는 심한 출혈과 동맥 공급 장치의 손상을 초래할 수 있습니다.
환기 설정은 동물의 연령에 따라 선택된다.대부분의 상용 공급 업체는 이러한 설정에 대한 유용한 정보를 제공합니다. P15보다 나이가 쥐의 실험은 큰 동물 인공 호흡기의 사용이 필요합니다. 성인 동물 마취제 / 자일 라진 마취 경우 환기가 필요하지 않을 수도 있지만, 삽관 법은 기관들이 유체를 방지하는 것이 좋습니다.
본 프로토콜의 하나의 주된 제한은 실험만을 심하게 수행 될 수 있다는 것이다. 우리의 실험실에서 우리는 두 가지와 최대 10 시간 정도 지속되는 실험을 수행했습니다. 두 번째 제한은 실험 마취하에 수행해야한다는 것입니다. 따라서 마취의 선택은 실험의 계획 및 설계에서 고려해야 할 중요한 변수이다. 관련 문제는 신생아 동물 했나봐에 특히 민감 할 수 있다는 것입니다. 예를 들면, 케타민 / 자일 라진 혼합을 선택할 경우, 강아지의 중량을 기준으로 용량을 계산하고 최대 볼륨의 ⅓에 약물을 투여. 발가락 핀치 R로 5-10 분 간격으로 동물의 상태를 확인esponse. 이소 플루 란을 사용하는 경우의주의 사항도 조사 (통풍 및 올바르게 조정 기화기)를 위해 안전한 환경을 유지하기 위해 필요합니다.
실체는 이광자 현미경으로 전극 및 동물의 재배치를 배치 시야각을 조정 및 공간 간극을 용이하게하기 위해가요 성 홀더에 장착 될 수있다. 인공 호흡기에 전원을 공급하기 위해 배터리를 사용하면 동물을 이동 촉진하고 전기 생리학 실험을하는 동안 전기 아티팩트를 줄일 수 있습니다. 이를 위해 작은 브레드 (7.5 × 12 인치) 인공 호흡기, 가열 패드와 마취 된 동물 (도 2a)를 함께 조립하기 위해 사용될 수있다. 이 설정에 대한 유용하고 중요한 수정은 수술하는 동안 생체 신호를 모니터링 할 수있는 장치의 추가이다. 맥박 산소 측정기 또는 다른 아날로그 장치는 실험실 예산에 따라 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 전기 생리학과 만난 영상에 사용 된패치 클램프 녹음 8,10,11, polytrode 레코딩 (도 7), 두 개의 광자 촬상 구 등 hods, (도 6 및도 8). 한 가지 가능한 미래의 응용 프로그램은 전기 생리학 기록 16에 형광 표지 세포를 대상으로 이러한 방법을 결합하는 것입니다.
새로운 이미징 응용 프로그램은 2-D 또는 두 광자 현미경을 사용하여 3-D 시계열을 포함 할 수있다. 예를 들어, 뇌간의 신경 세포와 아교 세포 집단의 활동을 연구하는 칼슘 지표 러스 로딩을 사용. 도 8에 도시 된 바와 같이, 염료 용액은 경동맥을 통해 혈액 순환 내로 주입은 뇌 혈관의 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 데 사용될 수있다. 형광 염료는 미세 혈관 내강을 채우고 주변 조직에 퍼져로서, 용질 확산 COEF는 혈액 뇌 장벽의 겉보기 용질 투과성을 계산 뿐만이 아니라 사용될 수있다뇌 조직 3 ficient. 경동맥을 통해 찬란 용질을 주입하기위한 하나의 주 이유는 염료 용액에 직접 꼬리 정맥 주입과 같이 먼저 마음을하지 않고 뇌의 미세 혈관에 갈 수 있다는 것입니다. 이것은 적어도 두 가지 장점을 제공합니다. 하나는 관류 속도가 삽관 사이트에 고정되어있는 경우 미세 혈관 내강에서 형광 염료의 농도가 실질적으로 일정하게 될 수 있다는 것이다. 이 혈액 – 뇌 장벽의 투과성의 정확한 결정을 보장한다. 또 다른 테스트 에이전트는 관류에 포함되면, 그것이 직접 신체 순환에서 다른 요소로 희석하거나 결합되지 않고 혈액 – 뇌 장벽으로 이동한다는 것이다.
새로운 실험은 유전자 인코딩 형광 기자들과 형질 전환 동물의 장점을 취할 수있다. 이것은 (형광 프로브 반응계에로드 할 필요가 있다는 것이 이점을 제공하지 않는 한 실험의 설계시간을 절약하거나 더 그대로 준비 (예를 들어 두개골 창 (17))를 허용), 그렇지 않으면 상태.
마지막으로, 실험은 열등 올리브 또는 얼굴 모터 핵 뇌간과 같은 다른 영역에서 수행 될 수있다. 특정 종의 특정 세포 집단의 신경 해부학 및 개발에 대한 지식은 해부학 적 동물 (그림 1) 성장에 따라 변경 될 수 있습니다 특히,이 끝 부분에 중요하다. 우리는이 프로토콜은 생체 전기 생리학 및 이미징 방법에 사용하여 복부 뇌간의 구조를 연구하기 위해 다른 사람을 격려 바랍니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH / NCRR / RCMI에서 부여 G12-RR003060에 의해 지원되었다, 새로운시 대학에서 아동 건강 및 인간 발달, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) CBET 0,754,158 및 PSC-CUNY 62337-00 (40)의 유니스 슈라이버 국립 연구소에서 SC1HD068129을 부여 뉴욕.
Materials
| Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
| Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
| Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
| Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
| DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
| Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
| Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
| Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
| Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
| Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
| Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
| Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
| Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
| Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
| Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
| Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
| Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |
References
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