Een methode om een Craniotomie aan de ventrale Schedel van pasgeboren knaagdieren maken
Summary
Een chirurgische methode wordt beschreven om de ventrale schedel aan pasgeboren ratten bloot. Met deze benadering is het mogelijk om een craniotomie acute elektrofysiologie en twee-foton microscopie experimenten in de hersenstam van verdoofde pups openen.
Abstract
Het gebruik van een craniotomie voor in vivo experimenten biedt de gelegenheid om de dynamiek van diverse cellulaire processen in de hersenen van zoogdieren in volwassenheid en tijdens de ontwikkeling te onderzoeken. Hoewel de meeste in vivo benaderingen een craniotomie om hersengebieden gelegen aan de rugzijde te bestuderen, hersenstam regio's zoals de pons, gelegen aan de buikzijde blijven relatief weinig bestudeerd. Het belangrijkste doel van dit protocol is om de toegang tot ventrale hersenstam structuren te vergemakkelijken, zodat ze kunnen worden onderzocht in vivo met behulp van elektrofysiologische en beeldvorming. Deze benadering maakt onderzoek naar structurele veranderingen in lange afstand axonen, patronen van elektrische activiteit in enkele en combinaties van cellen en veranderingen in bloed-hersen barrière permeabiliteit aan pasgeboren dieren. Hoewel dit protocol is vooral gebruikt om de auditieve hersenstam aan pasgeboren rat model, kan het gemakkelijk worden aangepast voor andere studies in knaagdieren zoals pasgeboren muizen, volwassen rodents en andere hersenstam regio.
Introduction
Het gebruik van een craniotomie in combinatie met fluorescentie beeldvorming en elektrofysiologie technieken voor het bewaken bloedstroom, bloed-hersen barrière permeabiliteit en meten van de activiteit van neuronen en gliale cellen in levende dieren 1-3. Verschillende laboratoria hebben deze benadering gebruikt om inzicht te geven in de hersenen fysiologie in gezonde en aandoeningen, maar verschillen blijven in ons begrip van hoe deze processen zich voordoen tijdens de ontwikkeling. Voorts hebben de meeste studies gericht op hersengebieden die gemakkelijk bereikbaar vanaf het dorsale oppervlak van de schedel, zodat ventrale hersenstam structuren met verschillende fysiologische rollen zijn voornamelijk bestudeerd met behulp van ex-vivo onderzoek.
Het belangrijkste doel van dit protocol is een methode voor het openen van een craniotomie aan de ventrale schedel van knaagdieren te bieden. Deze aanpak werd aangepast van klassieke studies uitgevoerd in grotere zoogdieren zoals honden en katten voor zintuiglijke neurofysiologie recordings van de auditieve hersenstam 4-7. In dit protocol is er echter de nieuwe uitdaging van het uitvoeren van de procedure aan pasgeboren dieren. Met vasculatuur oriëntatiepunten, heeft deze aangepast protocol al eerder gebruikt om de auditieve hersenstam van pasgeboren ratten volwassen muizen en andere hersenstam regio's zoals de oliva 8-11 (Figuur 1) te bestuderen.
Een belangrijk voordeel van een ventrale craniotomy over bestaande methoden om ventrale hersenstamkernen studie is dat het biedt directe toegang tot de structuren van belang in levende dieren. Bijvoorbeeld, worden de auditieve cellen van de superieure olivary complex gelokaliseerd enkele tientallen micrometers van het hersenoppervlak, wat belangrijk is voor gerichte plaatsing van sondes en voor het gebruik van twee-foton beeldvormingsbenaderingen waarin beeldvorming diepte beperkt tot 0,5 mm door licht weefsel verstrooiing en absorptie. Een ventrale craniotomy biedt ook een voorbereiding met relatief intacte neurale verbindingen, which verstoord in acute en organotypische slice preparaat 12. In tegenstelling tot andere protocollen voor in vivo experimenten neurofysiologie 13, kan een ventrale benadering gecombineerd met multi-elektrode opname en beeldvorming die informatie over cellulaire ensembles verschaffen (figuren 6 en 7). Tenslotte, in combinatie met dit protocol een fluorescent gelabelde opgeloste stof kan worden geïnjecteerd in de vasculatuur veranderingen in bloed-hersen barrière permeabiliteit voor de opgeloste stof (Figuur 8) te meten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Is kritisch. Een ervaren onderzoeker moet in staat zijn om dit protocol te ronden in 1 uur (stappen 1-3). De aangegeven tijden voor de verschillende stappen gaan uit van een gemiddeld tot hoog niveau van deskundigheid. Juiste en tijdige tracheotomie en intubatie zijn kritisch, omdat slechte ventilatie controle kan leiden tot stikken en de dood van het dier. Zorgvuldige klaring van spier-en vetweefsel is ook erg belangrijk, want fouten kunnen leiden tot ongecontroleerde bloeden en de dood van het dier. Ook wanneer de voorbereiding van de halsslagader voor canule inbrengen, moet men zorgvuldig te scherpen en snijd de slagader, als de draad knoop losraakt ongecontroleerde bloeden zal plaatsvinden. Ten slotte moet de craniotomie zorgvuldig worden gemaakt, zonder verstoring van het vaatstelsel bezienswaardigheden. Onzorgvuldig verwijderen van de externe meningeale laag (dura) kan leiden tot ernstige bloeden en beschadiging van de arteriële aanvoer.
Ventilatie instellingen worden gekozen op basis van de leeftijd van het dier.De meeste commerciële leveranciers bieden nuttige informatie over dergelijke instellingen. Experimenten bij ratten ouder dan P15 zal gebruik maken van een groot dier ventilator nodig. Volwassen dieren mogen niet ventilatie nodig als verdoofd met ketamine / xylazine, maar intubatie wordt aanbevolen om fluïdum dat de luchtpijp te voorkomen.
Een belangrijke beperking van dit protocol is dat experimenten alleen acuut kan worden uitgevoerd. In ons laboratorium hebben we experimenten duurzaam uitgevoerd tussen twee en maximaal tien uur. Een tweede beperking is dat experimenten onder verdoving worden uitgevoerd. Daarom is de keuze van de verdoving is een belangrijke variabele te overwegen bij het plannen en ontwerpen van experimenten. Een verwant probleem is dat pasgeboren dieren bijzonder gevoelig zijn voor overdosering kunnen zijn. Als bijvoorbeeld kiezen ketamine / xylazine mengsel Bereken de dosis vanwege het gewicht pup en beheren drugs op ⅓ van het maximale volume. Controleer de toestand van het dier elke 5-10 minuten met de teen knijpen response. Bij gebruik van isofluraan, zijn voorzorgsmaatregelen ook nodig om een veilige omgeving te handhaven voor de onderzoeker (goede ventilatie, en een deugdelijk gekalibreerde verdamper).
De stereomicroscoop kan op een flexibele houder worden gemonteerd kijkhoek aan te passen en ruimte klaring vergemakkelijken elektroden en verplaatsing van het dier te plaatsen aan de twee-foton microscoop. Gebruik van een batterij om de ventilator van stroom te kunnen vergemakkelijken het verplaatsen van de dieren-en elektrische artefacten te verminderen tijdens elektrofysiologische experimenten. Hiertoe kan een kleine breadboard (7,5 x 12 inch) worden gebruikt om de montage van de ventilator, verwarming pad en het verdoofde dier (Figuur 2a). Een bruikbare en belangrijke wijziging van deze opstelling is de toevoeging van een inrichting voor het bewaken vitale functies tijdens chirurgie. Een oxymeter of andere analoge apparaten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het laboratorium budget.
Dit protocol is gebruikt met de elektrofysiologie en imaging voldaanhods, waaronder patch clamp 8,10,11, polytrode opnamen (figuur 7), en twee-foton beeldvorming 9 (figuren 6 en 8). Een mogelijke toekomstige toepassing zou zijn om deze methoden te combineren voor het richten van fluorescent gelabelde cellen voor elektrofysiologische opname 16.
Nieuwe beeldvormende toepassingen kunnen ook 2-D of 3-D tijdreeksen met twee-foton microscopie. Bijvoorbeeld met behulp bolus laden van calcium indicatoren voor de activiteit van hersenstam neuronale en gliale celpopulaties te bestuderen. Zoals getoond in figuur 8, een kleurstof oplossing geïnjecteerd in de bloedsomloop via de halsslagader kan worden om contrastrijke beelden van de hersenen vasculatuur genereren. Omdat de fluorescentie kleurstof vult het microvaatje lumen en verspreidt in het omringende weefsel, kan niet alleen worden gebruikt voor de berekening van de opgeloste schijnbare permeabiliteit van de bloed-hersen barrière, maar ook de opgeloste stof diffusie coëfficiëntcoëfficiënt in het hersenweefsel 3. Een belangrijke reden voor het injecteren van de fluorescent gelabelde opgeloste stoffen via de halsslagader is dat de kleurstof oplossing direct kan gaan naar de bloedvaten in de hersenen zonder naar het hart eerst als in een staart ader injectie. Dit brengt ten minste twee voordelen. Een daarvan is dat de fluorescentie kleurstof concentratie in de microvessel lumen nagenoeg constant kan zijn als de perfusie percentage is vastgesteld op de canulatieplaats. Dit zorgt voor een nauwkeurige bepaling van de bloed-hersen barrière permeabiliteit. Een andere is dat als een testmiddel wordt in het perfusaat, zal het direct naar de bloed-hersen barrière zonder verdund of in combinatie met andere factoren uit het bloedsomloop.
Nieuwe experimenten kunnen ook gebruik maken van met genetisch gecodeerd fluorescerende reporters transgene dieren. Dit zou het voordeel dat fluorescerende probes niet hoeft in situ worden geladen verschaffen (indien het model van de proefanders is bepaald), bespaart tijd en mogelijk waardoor meer intacte preparaten (bijv. craniale venster 17).
Ten slotte kan experimenten worden gedaan in andere hersenstam regio's zoals de inferieure olijf-of het gezicht motor nucleus. Kennis over neuro-anatomie en de ontwikkeling van specifieke cellulaire bevolking in een bepaalde soort is van groot belang om dit doel, vooral als anatomische oriëntatiepunten kunnen veranderen als dieren groeien (figuur 1). We hopen dat dit protocol spoort anderen aan ventrale hersenstam structuren te bestuderen met behulp van in vivo elektrofysiologische en beeldvorming.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidie G12-RR003060 van NIH / NCRR / RCMI verlenen SC1HD068129 van het Eunice Shriver National Institute of Child Health & Human Development, National Science Foundation CBET 0.754.158 en PSC-CUNY 62337-00 40 van de City University van New York.
Materials
| Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
| Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
| Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
| Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
| DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
| Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
| Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
| Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
| Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
| Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
| Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
| Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
| Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
| Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
| Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
| Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
| Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |
References
- Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Sigler, A., Murphy, T. H. In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke. Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).
- Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy. ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).
- Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. Microelectrode study of superior olivary nuclei. Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).
- Goldberg, J., Brown, P. B. Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization. J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).
- Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties. Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).
- Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).
- Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Rodríguez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse. J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).
- Tritsch, N. X., Rodríguez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset. Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).
- Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture. J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).
- Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., Rübsamen, R. Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice). J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).
- García-Villalón, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., Gómez, B., Diéguez, G. Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis. Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).
- Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels. Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Haüsser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
