وهناك طريقة لجعل حج القحف على بطني من الجمجمة الوليد القوارض
Summary
ووصف الطريقة الجراحية لفضح الجمجمة البطني في الفئران حديثي الولادة. باستخدام هذا النهج فمن الممكن لفتح حج القحف لأداء الكهربية الحادة واثنين من الفوتون المجهري التجارب في الدماغ من الجراء تخدير.
Abstract
استخدام حج القحف لفي التجارب المجراة يوفر فرصة للتحقيق في ديناميات العمليات الخلوية المتنوعة في أدمغة الثدييات في مرحلة البلوغ وخلال التنمية. على الرغم من أن معظم المجراة نهج استخدام حج القحف لدراسة مناطق الدماغ التي تقع على الجانب الظهري والمناطق جذع الدماغ مثل الجسر، وتقع على الجانب البطني تبقى سلوكه نسبيا. الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لتسهيل الوصول إلى هياكل الدماغ البطني بحيث يمكن دراستها في الجسم الحي باستخدام الكهربية وأساليب التصوير. يسمح هذا النهج دراسة التغيرات الهيكلية في محاور عصبية طويلة المدى، وأنماط من النشاط الكهربائي في واحد ومجموعات من الخلايا، والتغيرات في نفاذية حاجز الدم في الدماغ في الحيوانات الوليد. على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تستخدم في الغالب لدراسة الدماغ السمعية في الفئران حديثي الولادة، ويمكن بسهولة أن تتكيف للدراسات في أنواع القوارض الأخرى مثل الفئران حديثي الولادة، رودين الكبارالخبر ومناطق الدماغ الأخرى.
Introduction
استخدام حج القحف في تركيبة مع التصوير مضان والتقنيات الكهربية يسمح تدفق الدم الرصد، نفاذية حاجز الدم في الدماغ وقياس نشاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الحيوانات الحية 1-3. وقد استخدمت العديد من المختبرات هذا النهج إلى توفير نظرة ثاقبة فسيولوجيا الدماغ في ظروف صحية والمرض، ولكن لا تزال هناك فجوات في فهمنا للكيفية التي تنشأ هذه العمليات خلال التنمية. وعلاوة على ذلك، ركزت معظم الدراسات على مناطق الدماغ التي يسهل الوصول إليها من السطح الظهري من الجمجمة، بحيث هياكل الدماغ البطني مع الأدوار الفسيولوجية المختلفة وقد تم دراسة معظمها باستخدام فيفو السابقين النهج.
الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو لتوفير وسيلة لفتح حج القحف على الجمجمة بطني من القوارض. وقد تم تكييف هذا النهج من الدراسات الكلاسيكية التي أجريت في الثدييات الكبيرة مثل الكلاب والقطط لريكو الفسيولوجيا العصبية الحسيةrdings من الدماغ السمعية 4-7. في هذا البروتوكول ومع ذلك، هناك التحدي الرواية من تنفيذ الإجراء في الحيوانات الوليد. باستخدام المعالم الأوعية الدموية، وقد استخدم هذا البروتوكول تكييفها سابقا لدراسة الدماغ السمعية من الفئران حديثي الولادة، والفئران الكبار ومناطق الدماغ الأخرى مثل الزيتون أدنى 8-11 (الشكل 1).
والميزة الرئيسية لحج القحف بطني على الطرق القائمة لدراسة نوى الدماغ البطني هو أنه يوفر الوصول المباشر إلى هياكل الفائدة في الحيوانات الحية. على سبيل المثال، يتم ترجمة الخلايا السمعية من مجمع الزيتوني متفوقة بضع عشرات من ميكرومتر من سطح الدماغ، وهو أمر مهم لوضع المستهدفة من تحقيقات واستخدام النهج التصوير ثنائي الفوتون في عمق التصوير التي يمكن أن تقتصر على 0.5 مم تشتت الضوء وامتصاص الأنسجة. يوفر حج القحف بطني أيضا إعداد مع الوصلات العصبية سليمة نسبيا، ذوي الخوذات البيضاءتتعطل معنوى في الاستعدادات شريحة الحادة وعضوي النمط 12. وعلى النقيض من البروتوكولات الأخرى لفي التجارب المجراة الفسيولوجيا العصبية 13، ويمكن الجمع بين نهج بطني مع تسجيل متعدد القطب وأساليب التصوير التي توفر معلومات حول الفرق الخلوية (أرقام 6 و 7). أخيرا، في تركيبة مع هذا البروتوكول المذاب fluorescently المسمى يمكن حقنها في الأوعية الدموية لقياس التغيرات في نفاذية حاجز الدم في الدماغ إلى المذاب (الشكل 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
الوقت أمر بالغ الأهمية. يجب أن يكون الباحث من ذوي الخبرة قادرة على استكمال هذا البروتوكول في 1 ساعة (الخطوات 1-3). في أوقات محددة لمختلف الخطوات تفترض المتوسط إلى مستوى عال من الخبرة. القصبة الهوائية المناسبة وفي الوقت المناسب والتنبيب حاسمة، لأن ضعف السيطرة التهوية يمكن أن يؤدي إلى الاختناق والموت للحيوان. إزالة حذرا من أنسجة العضلات والدهون هو أيضا مهم جدا لأن الأخطاء يمكن أن يؤدي إلى نزيف غير المنضبط وفاة الحيوان. وبالمثل، عند إعداد الشريان السباتي للقنية الإدراج، ويحتاج المرء لتشديد وقطع الشريان بعناية، وإذا كانت عقدة يصبح موضوع فضفاض النزيف غير المنضبط سوف تأخذ مكان. أخيرا، ينبغي بذل حج القحف بعناية، دون تعطيل المعالم الأوعية الدموية. إزالة الإهمال طبقة السحائي الخارجية (الجافية) يمكن أن يؤدي إلى نزيف حاد وتلف من إمدادات الشرياني.
ويتم اختيار إعدادات التهوية وفقا لعمر الحيوان.توفر معظم الموردين التجاريين معلومات مفيدة حول هذه الإعدادات. والتجارب في الفئران الأكبر سنا من P15 تتطلب استخدام جهاز التنفس الصناعي الحيوانات الكبيرة. الحيوانات البالغة قد لا تحتاج تهوية إذا تخدير مع الكيتامين / زيلازين، ولكن ينصح التنبيب لتجنب السوائل دخول القصبة الهوائية.
واحد القيد الرئيسي من هذا البروتوكول هو أن التجارب لا يمكن إلا أن يؤديها بشكل حاد. في المختبر لدينا قمنا بإجراء التجارب دائم بين سنتين وحتى عشر ساعات. والقيد الثاني هو أن التجارب يجب أن تتم تحت التخدير. لذا، فإن اختيار مخدر هو متغير المهم النظر في تخطيط وتصميم التجارب. وثمة مسألة ذات الصلة هو أن الحيوانات الوليد يمكن أن تكون حساسة بشكل خاص لجرعة زائدة. على سبيل المثال، اذا كان اختيار الكيتامين / زيلازين المزيج، وحساب الجرعة على أساس الوزن الجرو وإدارة المخدرات في ⅓ من الحد الأقصى للحجم. التحقق من حالة الحيوان كل 5-10 دقائق بواسطة إصبع قرصة صesponse. إذا باستخدام isoflurane و، وهناك حاجة أيضا الاحتياطات للحفاظ على بيئة آمنة للمحقق (التهوية المناسبة، والمرذاذ معايرتها).
وstereomicroscope يمكن تركيبه على حامل مرنة لضبط زاوية عرض وتسهل إزالة مساحة لوضع الأقطاب ونقل الحيوان إلى مجهر ثنائي الفوتون. استخدام بطارية لتشغيل جهاز التنفس الصناعي يمكن أن تسهل نقل الحيوانية والحد من القطع الأثرية الكهربائية خلال التجارب الكهربية. تحقيقا لهذه الغاية، اللوح الصغيرة (7.5 × 12 بوصة) يمكن استخدامها لتجميع معا التنفس الصناعي، وسادة التدفئة وتخدير الحيوانات (الشكل 2A). وهناك تعديل مفيدة ومهمة لهذا الإعداد هو إضافة جهاز لرصد المؤشرات الحيوية أثناء الجراحة. على مقياس التأكسج أو الأجهزة التناظرية أخرى يمكن استخدامها تبعا للميزانية المختبر.
وقد استخدم هذا البروتوكول مع الكهربية والتصوير التقىhods، بما في ذلك تسجيلات المشبك التصحيح 8،10،11 والتسجيلات polytrode (الشكل 7)، واثنين من الفوتون التصوير 9 (أرقام 6 و 8). واحد من شأنه تطبيق محتملة في المستقبل يكون الجمع بين هذه الأساليب لاستهداف الخلايا fluorescently المسمى لتسجيل الكهربية 16.
تطبيقات التصوير الجديدة يمكن أن تشمل أيضا 2-D أو 3-D السلسلة الزمنية باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. على سبيل المثال، وذلك باستخدام بلعة تحميل مؤشرات الكالسيوم لدراسة نشاط الدماغ العصبية والسكان الخلية الدبقية. كما هو موضح في الشكل 8، حقن محلول الصبغة في الدورة الدموية من خلال الشريان السباتي يمكن استخدامها لتوليد الصور عالية التباين من الأوعية الدموية في الدماغ. كما يملأ صبغ مضان التجويف microvessel وينتشر في الأنسجة المحيطة بها، ويمكن استخدامه ليس فقط لحساب نفاذية المذاب واضح من حاجز الدم في الدماغ ولكن أيضا COEF المذاب نشرficient في أنسجة المخ 3. أحد الأسباب الرئيسية لحقن المواد المذابة fluorescently المسمى عبر الشريان السباتي هو أن محلول الصبغة يمكن أن تذهب مباشرة إلى microvessels في الدماغ من دون الذهاب الى قلبية للمرة الأولى كما هو الحال في حقن الوريد الذيل. هذا يجلب اثنين على الأقل من المزايا. واحد هو أن تركيز صبغ مضان في التجويف microvessel يمكن أن يكون ثابتا عمليا إذا تم إصلاح معدل نضح في موقع القسطرة. وهذا يضمن تحديد دقيق للنفاذية حاجز الدم في الدماغ. آخر هو أنه إذا كان يتم تضمين وكيل الاختبار في الإرواء، وسوف تذهب مباشرة إلى حاجز الدم في الدماغ دون أن تضعف أو جنبا إلى جنب مع عوامل أخرى من الدورة الدموية في الجسم.
التجارب الجديدة أيضا قد تستفيد من الحيوانات المعدلة وراثيا مع صحفيين الفلورسنت المشفرة وراثيا. وهذا من شأنه توفير ميزة أن تحقيقات الفلورسنت لن تحتاج إلى تحميل في الموقع (إلا إذا كان تصميم التجربةينص على خلاف ذلك)، وتوفير الوقت والسماح لمزيد من الاستعدادات سليمة (مثل النافذة في الجمجمة 17) ربما.
أخيرا، والتجارب ويمكن أن يتم في مناطق الدماغ الأخرى مثل الزيتون أو أدنى نواة المحرك الوجه. سوف المعرفة حول التشريح العصبي وتطوير السكان الخلوية محددة في نوع معين من المهم لتحقيق هذه الغاية، لا سيما المعالم التشريحية قد تتغير كما تنمو الحيوانات (الشكل 1). ونحن نأمل أن يكون هذا البروتوكول تشجع الآخرين لدراسة هياكل الدماغ البطني باستخدام الكهربية في الجسم الحي وأساليب التصوير.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل عن طريق منحة G12-RR003060 من المعاهد الوطنية للصحة / NCRR / RCMI، منح SC1HD068129 من المعهد الوطني يونيس شرايفر الصحة والإنسان لتنمية الطفل، ومؤسسة العلوم الوطنية CBET 0754158 وPSC-62337-00 جامعة مدينة نيويورك 40 من جامعة مدينة نيو نيويورك.
Materials
| Absorbant pads | Kettenbach | Sugi 31603 | Other options may be available from different companies |
| Cautery | Braintree Scientific, INC | GEM 5917 | Other options may be available from different companies |
| Tetramethyl rhodamine Isothiocyanate dextran | Sigma | T1287-500MG | Other options may be available from different companies |
| Dissecting Chisel | Fine Science Tools | 10095-12 | Other options may be available from different companies |
| DiI | Invitrogen | V-22885 | Other options may be available from different companies |
| Elastomer | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Other options may be available from different companies |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | Other options may be available from different companies |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12,11617-12, 11616-16 | Other options may be available from different companies |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | Other options may be available from different companies |
| Heating pad | FHC | 40-90-2 | Other options may be available from different companies |
| Intubation tubing | Braintree Scientific, INC | BIO CO-KIT | Choose age appropriate size |
| Light source | Spach Optics | Schott Ace illuminator | Other options may be available from different companies |
| Micro drill | Braintree Scientific, INC | MD-1200 120V | Other options may be available from different companies |
| Paper tape | Walgreens | Generic brand | Other options may be available from different companies |
| Syringe filter | VWR | 28145-483 | Other options may be available from different companies |
| Syringe pump | VWR | 52459-008 | Other options may be available from different companies |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | Other options may be available from different companies |
| Suture | Ethicon | Prolene 86979 | 6-0 size |
| Tubing | Braintree Scientific, INC | Micro-Renathane (MRE033); SUBL-120 | Other options depending on pup’s age |
| Vaporizer (isoflurane) | Vetequip Incorporated | 911103 | Other options may be available from different companies |
| Ventilator (minivent) | Harvard Apparatus | 730043 | Use for P0-P12 rats |
References
- Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat. Rev. Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Sigler, A., Murphy, T. H. In vivo 2-photon imaging of fine structure in the rodent brain: before, during, and after stroke. Stroke. 41 (10), 117-123 (2010).
- Shi, L., Zeng, M., Sun, Y., Fu, B. M. Quantification of blood-brain barrier solute permeability and brain transport by multiphoton microscopy. ASME J. of Biomech. Eng. 136 (3), 031005-031005 (2014).
- Galambos, R., Schwartzkopff, J., Rupert, A. Microelectrode study of superior olivary nuclei. Am. J. Physiol. 197, 527-536 (1959).
- Goldberg, J., Brown, P. B. Response of binaural neurons of dog superior olivary complex to dichotic tonal stimuli: some physiological mechanisms of sound localization. J. Neurophysiol. 32 (4), 613-636 (1969).
- Guinan, J. J., Guinan, S. S., Norris, B. E. Single auditory units in the superior olivary complex I: responses to sounds and classifications based on physiological properties. Intern. J. Neurosci. 4, 101-120 (1972).
- Spirou, G. A., Brownell, W. E., Zidanic, M. Recordings from cat trapezoid body and HRP labeling of globular bushy cell axons. J. Neurophysiol. 63 (5), 1169-1190 (1990).
- Khosrovani, S., Der Giessen, R. S. V. a. n., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Rodríguez-Contreras, A., Van Hoeve, J. S., Habets, R. L., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Lorteije, J. A., Rusu, S. I., Kushmerick, C., Borst, J. G. G. Reliability and precision of the mouse calyx of Held synapse. J. Neurosci. 29 (44), 13770-13784 (2009).
- Tritsch, N. X., Rodríguez-Contreras, A., Crins, T. T., Wang, H. C., Borst, J. G. G., Bergles, D. E. Calcium action potentials in hair cells pattern auditory neuron activity before hearing onset. Nat. Neurosci. 13 (9), 1050-1052 (2010).
- Tong, H., Steinert, J. R., Robinson, S. W., Chernova, T., Read, D. J., Oliver, D. L., Forsythe, I. D. Regulation of Kv channel expression and neuronal excitability in rat medial nucleus of the trapezoid body maintained in organotypic culture. J. Physiol. 588 (9), 1451-1468 (2010).
- Sonntag, M., Englitz, B., Kopp-Scheinpflug, C., Rübsamen, R. Early postnatal development of spontaneous and acoustically evoked discharge activity of principal cells of the medial nucleus of the trapezoid body: an in vivo study in mice). J. Neurosci. 29 (30), 9510-9520 (2008).
- García-Villalón, A. L., Roda, J. M., Alvarez, F., Gómez, B., Diéguez, G. Carotid blood flow in anesthetized rats: effects of carotid ligation and anastomosis. Microsurgery. 13 (5), 258-261 (1992).
- Yuan, W., Lv, Y., Zeng, M., Fu, B. M. Non-invasive method for the measurement of solute permeability of rat pial microvessels. Microvasc. Res. 77 (2), 166-173 (2009).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Haüsser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5 (1), 61-67 (2008).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
