Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi
Summary
Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.
Abstract
İnsan karaciğer doku içine lökosit infiltrasyonu tüm yetişkin inflamatuar karaciğer hastalıklarında yaygın bir süreçtir. Kronik sızma siroza fibrozis ve ilerleme gelişimini sürebilirim. Karaciğer lökosit işe aracılık moleküler mekanizmaların anlaşılması karaciğer hastalığı için önemli terapötik hedefler belirlemek olabilir. Lökositlerin toplanması sırasında önemli etkileşim kesme stresi koşulları altında endotel olan inflamatuar hücrelerin olmasıdır. Karaciğer İşe karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (HSEC) ile kaplı olan hepatik sinüzoidler düşük kesme kanallar içinde gerçekleşir. Hepatik sinusoidler içindeki koşullar spesifik akış oranlarında insan HSEC tekkatmanlar ile kaplı kanallardan lökositler delinmesiyle değinmeyecek edilebilir. Bu koşullarda, endotelyal lökosit üzerinde bir tarama adımı ve sonraki göçü ardından aktivasyon ve sağlam yapışma ve ardından kısa bir birleştirme adımı, geçmesikatmanı. Faz kontrast mikroskobu kullanarak, bu 'yapışma çağlayan' her adımı görsel ve çevrimdışı analiz takip kaydedilebilir. Endotelyal hücreleri ya da lökositler, bu işlem sırasında özel moleküllerin rolü belirlemek için inhibitörleri ile muamele edilmiş olabilir.
Introduction
Bu şimdi de genel lökosit işe aşamalı yapışma kaskad 1 paradigma izler kurulmuştur. Bu durum, kap duvarını kaplayan endotel hücreler tarafından kan akışını lökositlerin yakalama içerir. İlk olarak, lökosit reseptörleri ya da imünoglobülin üst ailesinin üyelerini selektin aracılık ettiği bir haddeleme aşamasından geçen. Bu G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) endotel glikokaliks sunulan kemokinler ile aktive edilecek olan lökosit yüzeyinde ifade sağlar. Bu lökosit yüzey üzerinde bir 'yüksek afinite' durumuna integrin onay değişime yol açar ve tutuklama ve endotele firma yapışma. Firma yapışma sonra kabın üzerine lökosit şekli değişikliği ve taranmasına izlemektedir. Son adım paraselüler veya hücre üzerinden yolları ile de meydana gelebilir endotel mono-katman, bir göç yoluyla.
Aşamalı yapışma kaskad tarif ederkens vücut içinde lökosit işe genel mekanizma organa özgü farklılıklar vardır. Karaciğerde lökosit işe çoğunluğu genel olarak işe sonrası kılcal venüllerin 2 içinde ortaya çıkar diğer organlarda aksine hepatik sinüzoidlerdeki içinde gerçekleşir. Hepatik sinüzoidlerle düşük kesme ortam vardır ve lökosit bağımsız 2 Selektin olduğunu yapışma sıkılaştırmak için önce kısa bir birleştirme adımı tabi. Bu kanallar süreksiz ve Fenestrae, çapı açık gözenekler 100-200 nm içeren hepatik sinüzoidal endotel kaplı ve bir bazal membran 3 yoksundur. Insan hepatik sinüzoidal endotelyumda lökosit işe aracılık moleküler mekanizmaların tanıtılması organ enflamatuvar karaciğer hastalıkları için spesifik tedavi hedefleri belirlemek olabilir.
Akış yapışma deneyleri lökosit işe okuyan temel araçlardır. Onlar izin lökosit Recru yeniden inşasıiyi tanımlanmış kuvvetler altında yapışma analiz etmek için kesme geriliminin varlığında itment. Analiz için en sık kullanımı, kültürlü endotelyal ya da saflaştırılmış tek tabakaları alt-tabakalar için, çalışma lökosit yapışma sağlamaktır. Ticari olarak temin edilebilen akış gözlerinden iki yassı yüzey arasında laminar akış koşulları altında hücreleri perfüze edilmesi ve daha sonra mikroskop 4 yapışmasının dinamik işlemini görselleştirmek için kullanılır. Önceki gruplar belli yapışkan etkileşimler sadece akış altında yer aldığını göstermiştir ve statik deneylerinde 5,6 okudu edilemez.
Biz karaciğer sinüzoidlerde recapitulate ve düşük kesme stres koşulları altında lökosit işe çalışmak için bu tekniği kullandık. Primer insan HSEC Lam ve lökositlerden kültürlenir daha sonra karaciğer sinüzoidlerdeki içindeki kayma gerilmesi üretmek için hesaplanan akış oranında bu tek tabaka üzerinden perfüze edilebilir. Kesme gerilimi OPP yüzeyine paralel veya teğet uygulanan bir strestirdik normal stres osed. Bir sınır boyunca hareket herhangi bir sıvı olduğunu sınırında bir makaslama stres yaratacaktır. Kesme gerilmesi lenfosit göçü 7 önemli bir bileşeni olduğu gösterilmiştir. Bu koşullar altında yapışma kaskadının her adım faz kontrast mikroskobu ile görselleştirilebilir. Bu yöntem, geleneksel bir yapışma moleküllerinin 8'in çalışma, kemokinlerin ve kemokin reseptörlerinin rolü, 9-11, ve bu damar yapışma proteini-1 (VAP-1 gibi atipik yapışma molekülleri de dahil olmak üzere karaciğer içinde lökositlerin işe önemli bilgiler sağlamıştır ) 8,12 ve ortak lenfatik ve vasküler endotelyal reseptörü-1 (ZEKİ-1) 13. Bu tahlil, bizim grubun yayınlarının birkaç söz edilmiş olmasına rağmen, onun açıklama kısa oldu ve biz gidermede yardımcı ve teknik hataları önlemek için adım kılavuz detaylı bir adım sağlamak için bu fırsatı almış zaman denemesitahlil ing. Ayrıca, son zamanlarda kayma gerilmesi doğru değişiklikler sağlar mikroslayd odaları kaynak değişti. Bu endotel ve diğer bağışıklık hücreleri için tahlil uygulanabilirliğini genişletmektedir inanıyoruz. Aşağıdaki yöntem, insan karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ve çevresel kan lenfositleri ile bir akış göre yapışma deneyi gerçekleştirilmesi için hazırlanmasını ve teknik anlatılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı bir akış deneyi gerçekleştirmek için en önemli nokta, endotel hücreleri, sağlıklı ve konfluent tek tabaka önce akış yapışma deneyi için hazır olduğunu garanti etmektedir. Primer endotelyal hücreleri kültürüne zor ve kültür yöntemleri değişikliklere karşı duyarlı olabilir. Bu 1) akış gözlerinden yeterli ve üniform bir tek tabaka endotel hücreleri ile kaplı olması önemlidir; HSEC için sıçan kuyruğu tip I kolajen kullanımı, ancak bu diğer endotel nüfus için farklı olabilir, 2) kültür ortamı için, hücre tipi için uygun HSEC biz protokol bölümünde bizim tam orta tarif var. Diğer önemli bir adım kesme geriliminin fizyolojik seviyelerini yansıtacak şekilde uygun oranda şırınga pompası ayar içerir.
Akış deneyi sırasında endotel tek tabaka zarar verebilir ya da endotel yüzeyinden bağışıklık hücreleri şerit olabilir, akış devresi içinde hava kabarcıklarını önlemek için gereklidir. Bu, en önlenebilirtüm silikon boru ve adaptörleri, tüm hava kabarcıkları çıkarılır ve ortam kullanımdan önce önceden ısıtılmış olduğu olduğu, bağlantıdan önce yıkama tamponu ile perfüze edilir ki suring. Bir sıvı / sıvı arayüz bağlantısı sırasında orada çok önemli olduğunu mikroslayd üzerinde limanlarına adaptörleri bağlarken herhangi bir hava varsa, o zaman bu şırınga çekilme sırasında endotel tek tabaka bozacak sistemi içinde bir hava boşluğu oluşturacak adım. Şırınga haznesinin lökosit solüsyon, hücreler bu şekilde, deney boyunca sabit bir hücre yoğunluğu sağlamak çökmeyen emin olmak için düzenli ajitasyon gerekmektedir.
Kayıt adımları sırasında endotel tabakasının görüntü yeterince hassas odaklı ve çevrimdışı analiz izin vermek için açık olduğundan emin olmak için önemlidir ve bu akış deneyi (sonrası lökosit bolus) ikinci aşaması esnasında yeterli bir süre, yıkama tamponu boyunca bırakılır Kayıttan önce faz sağlamak için tekrar başlatılırTüm nonadherent lökositler kaldırılır. Benzer şekilde dar kılcal akış modelleri engelleyebilir hücrelerin kaybını önlemek için ve aynı zamanda, faz kontrast mikroskobu ile daha büyük bir yapışkan lökositlerden ayırmak için zor olabilir, uygun yoğunlukta bir tek tabaka endotel hücrelerin kullanımı gereklidir. İnsan karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri için uygun tohumlama yoğunluğuna tarif ama bu farklı popülasyonlarda endotel ve türler arasında değişebilir.
Önemli bir ilerleme intravital mikroskobu ile hayvan modellerinde lökosit işe okuyan yapılmıştır. Akış yapışma deneyi yöntemin en önemli avantajı, lökosit işe primer insan endotel hücreleri ile ikili bir sistem içinde ele alınabilir olmasıdır. Dahası, bu etkileşimler makaslama stresin fizyolojik ilgili düzeyleri altında incelenebilir. Differenc olabilir gibi insan hücresel sistemler ile hayvanlarda Intravital çalışmaların bulguları doğrulamak için önemlidirtürleri arasında endotel özellikleri es. Akış testinin sınırlamalar biri lökosit işe endotel tek tabakalı bir tek hücreli ortamda okudu ediliyor olmasıdır. Lökositler endotelyumda yapıştırılır ve transmigrated kez ek olarak izole edildi ve sonraki işlemler maruz için yeterli sayıda mevcut olmayabilir.
Bu kısıtlamalara rağmen, akış yapışma deneyi hakim olmuştur kez lökosit yapışma kaskad daha analizini gerçekleştirmek için geliştirilmiş ve bir çok hücreli ortamı özetlemek için adapte edilebilir. Tek alanları ve izleme yazılımı kullanımı Uzun süreli kayıt lökositlerin sürünerek davranışını analiz etmek için kullanılabilir. Bundan başka, akış tahlilin tamamlanmasından sonra Lam daha ayrıntılı olarak yapışma ve transmigrasyonun çalışma için tarama lazer konfokal mikroskopi ile immünofloresan etiketleme kullanarak sorguya olabilir. Ayrıca, daha önceden geliştirmek varakan lökositler hepatositlerin varlığı ile şartlandırılmış karaciğer endotel etkileşebilen bir in vitro modeli ed. Bu deney aynı zamanda lökositlerin subpopülasyonunun incelemek için geliştirilmiş olabilir: grubumuz gibi düzenleyici T hücreleri, B hücreleri ve karaciğer infiltre lökositler gibi alt grupları ile çalışmalar yapılmıştır.
Bu çalışmalar akış yapışma deneyi, insan sistemlerinde genel ve organ spesifik lökosit işe incelemek için güçlü bir araç olduğunu kanıtlar vardır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SS Wellcome Trust Programı Grant tarafından Wellcome Trust Intermediate Klinik Bursu, CW tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name of the reagent/ Equipment | Company | Catalog number | Comments |
| Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber | Ibidi | 80601 | Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements. |
| Flow adaptors μ-slide VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
| Flow assay chamber | Solent Scientific | 33-3322 | These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. |
| Inverted Microscope IX2 | Olympus, UK | Model IX50 | |
| Harvard Syringe Pump | Harvard Apparatus, UK | 702101 | |
| Electronic solenoid valve | Lee Products Limited,UK | Part Number LFYA1226032H | |
| Silicon Tubing large | Fisher Scientific | FB50855 | 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter |
| Silicone Tubing-small | Fisher Scientific | FB50853 | 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter |
| Harvard Glass Syringe | Harvard Apparatus, UK | 55-0962 | |
| Cell separation medium/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
| Rat Tail Collagen | Sigma Aldrich | C3867-1VL |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65, 859-873 (1991).
- Finger, E. B., et al. Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear. Nature. 379, 266-269 (1996).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).
- Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines. Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).
- Lalor, P. F., et al. Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells. J. Immunol. 169, 983-992 (2002).
- Aspinall, A. I., et al. CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium. Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).
- Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow. Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).
- Oo, Y. H., et al. Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver. J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).
- Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein. J. Neural Transm. , (2013).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).
