Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Células-tronco e progenitoras neurais estão presentes em todo o SNC de mamíferos ^{1, 2.} A sua natureza e propriedades em zonas germinais embrionários e adultos que circundam as regiões do ventrículo do cérebro e da medula espinal tem sido extensivamente documentada na última década ^1-3. Em grande parte, isso se deve ao desenvolvimento de ferramentas genéticas cada vez mais precisos, como o sistema nervoso recombinação Cre específica de alelos floxed ou retroviral linhagem rastreamento ^4. No entanto, uma região-o progenitor exame abrangente pial progenitor superfície zona tem só recentemente foi descrito em detalhes ^5-7 e aguarda.

A superfície pial do cérebro é definida como a interface entre a superfície do cérebro e meninges circundantes ^8. Durante o desenvolvimento, neuroepithelial e, posteriormente, radiais metros finais da glia anexar a esta superfície ^9,10. Alguns dos abetost neurónios no cérebro humano e de muitos mitoses neuronais são observadas nesta região ^11. Mais tarde, durante a neurogénese embrionário, interneurónios corticais são conhecidos para atravessar a região pial, para além das suas rotas migratórias na zona intermédia e uma zona subventricular ^12-14. Durante este período, as células estaminais podem ser cultivadas a partir desta zona e que parece ser um sítio activo de neuro e gliogenesis ^5. No cérebro adulto, foi relatado que interneurónios pode ser carregado a partir de progenitores de superfície pial seguinte provocação hipóxica ^7. No entanto, a contribuição da região para sua a genensis durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal permaneceu obscura, em parte devido à dificuldade de investigar especificamente esta região ^6. No colículo superior, e no córtex cerebral, interneurónios superficiais (ou camada I no córtex) podem modular a saída do circuito de populações de neurónios excitatórios subjacentes e, portanto, contribuir significantly para a função destas estruturas. Em particular, uma camada de interneurônios estão em posição privilegiada para regular o disparo de neurônios ao longo das camadas superiores do córtex cerebral dada a sua ampla conectividade para as camadas superficiais e profundas das colunas corticais ^15,16. De maneira similar, interneurons horizontais receber entrada excitatória de fibras corticais e da retina, projeto sobre uma área relativamente grande e são especulado para mediar a inibição de populações neuronais que respondem a estímulos visuais remoto ^17,18. Além disso, a sua morfologia é bem adequada para desempenhar um papel potencial na actividade das ondas modelado no desenvolvimento do sistema visual ^19. Curiosamente, o desenvolvimento e maturação interneurônio acontece com um grande grau de pós-natal. Além disso, este processo de maturação foi encontrado para ser regulada por actividade neuronal e é, portanto, de um substrato de plasticidade de desenvolvimento ao longo da vida, com consequências sobre a função do circuito de ^20,21. Notavelmente, nO promotores são descritos que podem objetivar especificamente essas células transgenicamente. Progenitores em divisão pode ser alvo de retrovírus ^7, mas a produção do vírus é demorado e requer habilidade para produzir os títulos elevadas necessárias para a transdução de células.

Eletroporação levou a um renascimento no estudo do desenvolvimento neurológico, pois permite interrogatório genético rápido e eficiente de vias de sinalização das células precursoras neurais ^{4, 22, 23.} A electroporação envolve a injecção de DNA de plasmídeo, seguido pelo fornecimento de impulsos eléctricos para o exterior da cabeça, para conduzir unidireccionalmente do ADN nas células progenitoras que proliferam em torno dos ventrículos ^{4, 22, 23.} Electroporation parece requerer o trânsito de células através da fase M do ciclo celular para a expressão de transgenes de plasmídeo ^{de 24.} Especificamente, descobriu-se que somentecélulas que passam por fase M dentro de 8 horas de eletroporação de plasmídeos vai expressar transgenes apesar de sua entrega efetiva de todas as células dentro de ~ 160 mM da parede ventricular ^24. Especula-se que isto é devido à necessidade de repartição do envelope nuclear que permite o acesso nuclear dos plasmídeos epissomais, como produtos químicos que provocam a permeabilização nuclear pode induzir a expressão de plasmídeos nas células pós-mitóticas ^25. Originalmente utilizada no embrião ^22, electroporação foi adaptada para uso no cérebro pós-natal bem mais tarde ^{26, 27.} Recentemente, nós adaptamos electroporação para utilização na manipulação genética de células progenitoras de superfície pial ^6. Além disso, usando essa abordagem nós mostramos que há aparentemente duas linhagens distintas de células progenitoras na região-interneuronal e astrocitária ^6. Este protocolo detalha uma maneira simples, rápida e poderosa para direcionar essas células para o interrogatóriodo desenvolvimento de mecanismos de regulação destas células.