Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Bir deney kurma oldukça basit ve ölçüm kendisi tam otomatik, ama sık sık olduğu gibi, doğru analizi ve verilerin yorumlanması çok önemlidir. Temsilcisi veri bölümünde bir rehber ECIS ile empedans spektroskopi tarafından sağlanan en önemli parametrelerin yorumlanması sağlanır. Bu ECIS ölçüm parametreleri kayıt edilmelidir yararlı ve hangi olabilir bilimsel bir sorunun hangi tür karar vermek yararlı olacaktır. Tipik bir deneme-okuma genellikle hücre aşılanmasından ve hücreler kaynaşmaya eriştikten bir plato-aşamasından sonra bir büyüme aşamasında ayrılabilir. Bu aşamaların her biri, farklı hücresel özellikleri hakkında bilgi verir. Temsili bir ölçüm, Şekil 2'de gösterilen ve A) hücre yapışmasını analiz etmek için dört subphases ayrılır, yayma ve çoğalması olan, bir olgunlaşma EC bariyer B) oluşumu, C) Hücre göçü, bir elektrik üretilmesinden sonra), vazoaktif ajanın trombin ile uyarılmaya hücresel tepki ve D; al sarılır. Faz-kontrast ve immunofloresan görüntüleri elektrot kapsama, hücre durumu ve kaydedilen empedans sinyal arasındaki bağlantıyı göstermek için farklı subphases sırasında ölçüm elektrot doğrudan satın alındı. Yapışma, yayılma ve çoğalma Her hücre tipi, hücre dışı matris proteinleri veya başka bir uyarıcı ile kaplama, tohum yoğunluğu değiştirilerek manipüle edilebilir karakteristik yapışma ve bir büyüme eğrisi vardır. Bu çalışma süreçleri için önemli güçlüklerden biri, yayma ve çoğalma, yapışma ayırt etmektir. Wegener ve diğ. 11 direnci ve bu parametreleri ve Şekil 3 'de bu direnç ve kondansatör birbirlerini tamamlayıcı ne kadar belirgin hale gelir ayırt etmek için kapasitans bir kombinasyonunun kullanımı için ayrıntılı bir açıklamasını vermiştir. Bu önemlidiryapışma çalışması ve burada elektrik alan hücrelerin etrafında sadece akış akımı söz konusu süspansiyon 8, hücrelerin hücre membran polarizasyonu neden olur, çünkü, ölçüm frekans etkisini anlamak için yayılma. Hücreler, elektrot (fraksiyonel bölge) açık alan yüzdesi ile doğrusal bir şekilde elektrot kapasitansı ve azalmalar yayılarak akımı sınırlamak için başlangıç ​​iliştirdiğinizde. Kapasitans azalma elektrot içerisinde doğrudan orantılı olan 40 kHz (Şekil 3B), daha yüksek bir frekansta kapasitans kaydederken Bu nedenle, yapışma, yayma ve proliferasyonu, iyi tayin edilebilir. Alternatif olarak, en hassas ölçüm frekansında direnç konfluent bariyer içine farklılaşma ve hücre olgunlaşması (Şekil 3A) için doğrudan bir ölçüsüdür. Fraksiyonel alanına ek olarak, Wegener ve ark. Iki tanıtılant 1/2, elektrotun% 50 hücreleri (Şekil 3B, ekleme) ile kaplanmıştır zamana kadar olan süredir (yarım maksimum kapasite), ve kapasitans eğrisi (s değil, eğimi: yapışma ve elektrot kapsama alanı ölçmek için parametreler hücre çoğalması ve yayılması oranı olarak) gösterilmektedir. Bariyer bir kalite ölçüsü olarak Resistance Direnç Bu membran, elektrot ve ortamdan kapasitif bileşenleri ihmal için, bariyer kalite ve en iyi işlevi açıklanmaktadır empedansının bir parçasıdır. Geçirgenlik tanım başına hücre-hücre kişiler sadece bağımlı olduğundan burada terim bariyer kalitesi değil, geçirgenliği, kullanılır. Direnç, ancak akım akışını engellemek için hücre ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin yeteneği belirlenir. Bu duruma göre farklı hücre tipleri (klon ve geçitleri) kendi özel direnci değerleri (Şekil 4A) sahiptir. Direnci çok Clea vermesine rağmenHücre bariyer hakkında bir fikir rer, empedans sinyal her zaman dikkate alınmalıdır. Rb ve Alpha modellenmesi ECIS yazılımı, belirli bir özelliği barındıran, hücre-hücre ve hücre-matris adezyonlar (Şekiller 4B ve 4 ° C) arasında bir ayrım iki parametre, model yeteneği. Rb (cm x 2 ohm), akım akışının ve böylece klasik bir geçirgenliğe sahip bir ters ölçmek için hücre-hücre rehber özdirencini. Yüksek Rb akım akışının karşı düşük geçirgenliği ifade eder. Alpha (cm x 0.5 ohm), hücre-elektrot birleşme kaynaklanan empedans katkıları için bir ölçüdür. Hücre-hücre ve hücre-matriks kişileri ölçmek için bir model Giaever ve Keese tarafından 1991 yılında tanıtıldı ve hücreler dairesel olduğu varsayımına dayanır, bir yalıtım membranı vardır disk şeklindeki nesneler, elektrot üzerinde gezdirin ve elektrolit 2 iletken ile doldurulur .Hücre membran yalıtım özelliği akım için sadece üç yolları bırakır: a) hücre ve elektrot ventral yüzeyi arasında, b) hücre-hücre temas ve c) hücreleri ile arasında (yalnızca olası yüksek ölçüm frekans kullanıldığında .) Daha detaylı türetme ve açıklama Lo ve ark 3,12 arasında gazetelerde bulunabilir. Micromation Bu direnç sinyali (Şekil 4A) küçük dalgalanmaları ince, random hücre birleşik hücre tabakalarının hareketleri hem de hareket hücrelere ve seyrek kültürler 2'de elektrot kapalı bağlı olduğu gösterilmiştir. Lo ve Opp tarafından açıklanan ECIS zaman ders veri bu yönü vd. 13,14 sıklıkla gözden kaçan ve para-ve subsellüler akım yolları için hesap 1E diziler ve en hassas frekansta ölçerken iyi görülür. Bu hücrenin hesaplama gürültüsü (Mikrohareket) th parçası değil neden olduE standart ölçüm yazılımı, yeni sürümü Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) entegre olmasına rağmen. 4 kHz 1 saat için 1 Hz örnekleme frekansı ile RTC veri kayıt EC mikro-hesaplanması için yeterli çözünürlüğü sağlar. Bu hesaplama tek bir değer sağlar ve doğrudan istatistiksel analiz için kullanılabilir. Mikro-için frekans analizi kullanımı ile ilgili genişletilmiş bir tartışma başka bir yerde 15 bulunabilir. Alternatif FFT diğer analiz stratejileri artışlarla uymayacak gibi kullanılabilir. Varyans mikro-küçük değişimlere karşı daha duyarlı olan, ancak çünkü bu duyarlılık Tek tek deneylerin karşılaştırması zor olur. Güç spektrumunun yamaçlarında mikro-daha sağlam bir ölçüm (Şekil 4D) vardır. Burada eğrinin altında kalan alan ya da mikro-hücreler oluşturmak gürültü miktarı olarak görülebilir. Dolayısıyla, dik güç spektrumunun eğim eğrisinin altındaki alan daha küçükve Mikrohareket küçüktür. Elektrik yara iyileşmesi tahlil Hücrelerin göç çalışması için, genellikle mekanik yaralar pipet uçları, hücre kazıyıcı veya özel pulları ile kültür plakası kapalı hücreleri çizilmeye ve mikroskopik 16 onların geri dönüş izleyin tarafından uygulanır. Bu yöntem, sıfırdan boyutu değişir ve genellikle yara iyileşme süreci üzerinde hücre çoğalma etkisi ihmal için çok büyük olan belirgin bir dezavantajı vardır. ECIS ve yaralama işlevi, hücresiz bir elektrot elde etmek için bir yüksek gerilim, yüksek frekans sinyali kullanır ve daha sonra da ölüm hücreleri (Şekil 5A) değiştirmek için, komşu hücrelerin geri dönüş izler. Standart, emek yoğun sıfırdan deneyleri boyunca bu otomatik yöntemin bir avantajı, ECIS saf göç incelemek için bir kaç saat içinde kapanır 250 um kesin bir çapı olan bir yüksek oranda tekrarlanabilir yara, üretmesidir. Bundan başka, bir elektrik sinyali yapmakes protein kaplama ve salgılanan hücre dışı matriks kaldırmaz. Hücreler her taraftan elektrot üzerinde remigrate varsayımı altında, göç oranı kolayca yara kapama 17 için gerekli zaman yara yarıçapı bölerek hesaplanabilir. Elektrik yaralama bir alternatif olarak, yakın olarak adlandırılan elektrik çit yöntemi (gösterilmemiştir) ilave edildi. Burada yüksek akım darbeleri aşılamadan sonra elektrotlar üzerinde bağlanma ve hücre göçünü önler. Hücreler ölçüm elektrodun çevresinde büyümeye ve içeriye kısa sürede elektrik darbeleri kapalı olarak göç başlayacaktır. Elektrik yaralama üzerinde elektrikli çit avantajı elektrot yüzeyi hücre büyümesi veya hücre göçü farklı kaplamaların etkilerini ölçmek için önemlidir hücre çıkarma, tarafından değiştirilmiş değil olmasıdır. Hücre uyarma Hücre göçü çalışma ek olarak, mükemmel bir empedans spektroskopisi için uygunduruyuşturucu ve hücrelerin üzerine toksinlerin etkilerini ölçmek. Şekil 5B trombin direncinde geçici bir düşüş olarak tezahür hücrelerinin kasılma ve boşluk oluşumu ile birleşen AK bariyer hiper-geçirgenliği ikna etmek için kullanılan bir klasik stimülasyon / inhibisyon deneyi sunuyor . Rho kinaz inhibitörü Y-27632 ile ön-inkübasyon tarafından trombin tepkisinin en bazal hücre gerilimi 18 düşürülmesi ve stres lif oluşumu 19 engelleyerek azalır. Daha sonra Rho kinaz engelleyici AT bariyer derhal ve toplam kurtarma yol açan, trombin ilave edildikten sonra farklı zaman noktalarında kullanılmıştır. Burada akut hücresel yanıtları incelemek için sürekli bir empedans ölçüm sisteminin avantajı belirginleşmektedir. Düzenli uç tahlillerin (örn. immünoflüeresans boyama veya makromolekül geçit) olarak kullanılan engelleyici bu akut yanıtı belirlemek ve ölçmek için çok zor olmasa imkansız olurdu. Dikkat etmek önemlidir ile impedance ölçümleri iyonlarına karşı geçirgenlik makro moleküllerin karşı tarif edilen ve değildir. ECIS ölçümleri ve makromolekül geçiş deneyler arasında mükemmel bir karşılaştırma sağlanmıştır Aman et al. 20, bakınız. Şekil 2. Örnek ölçme. MVEC 5000 hücre / cm 2 ve MFT kayıt 10 gün boyunca gerçekleştirildi düşük tohumlama yoğunluğuna sahip bir jelatin kaplı 8W1E diziler üzerinde büyütüldü. Ölçüm, bir ECIS deney farklı salt çıkışları göstermektedir: A) yapışma, yayma ve yayılması; B) oluşumu ve bir birleşik hücre bariyer olgunlaşması, C) yara iyileşmesi bir elektrik yaranın uygulandıktan sonra, vazoaktif ile D) uyarma ajan trombin. İki ok orta işaret 4 gün aralıklarla gerçekleştirildi ve mekanik uyarıcılara ve sıcaklık ve pH değişikliklere karşı ölçümlerin hassasiyeti hakkında bir fikir vermek edildi içecek. Üst paneldeki görüntüler ölçüm karşılık ve ölçüm elektrot doğrudan satın alındı. Soldaki faz-kontrast görüntü elektrot karşılamak için başlangıç, 24 saat aşılamadan sonra endotel hücrelerini göstermektedir. Merkezinde ve birleşik endotel tabakasının sağ mevcut F-aktin üzerinde imüno-boyaması resim önce ve trombin (1 U / ml) ile uyarıldıktan sonra. Trombin sözde stres lif ve başlangıca direncinde bir düşüş ile ECIS sinyal tanınan arası endotel boşluklar (oklar ve görüntü parçaları) arasında geçici açıklığının oluşumu ile endotel hücreleri kasılmasına neden olur. Burada ölçüm hassasiyeti belirgin hale gelir ve hücre tabakası değişiklikler empedans sinyali ile ilişkili nasıl.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. Şekil 3,. Hücre bağlanma ve büyüme. MVEC aynı donörden jelatin kaplı 8W10E diziler ve hücre büyümesi 60 saat boyunca çok sayıda frekansta kaydedildi üç farklı yoğunluklara sahip ekilmiştir. A) 4 kHz arasında bir frekansta en elverişli koşulları için üç direnç değerlerini ölçmek bariyer oluşumu. Üç tohum yoğunluğu yaklaşık bir konfluent engel kurduk. Ölçüm sonunda 1.200 Ω,. Ancak çoğalma hızları (eğrilerin eğimleri) belirgin farklılıklar B) kapasitans ölçülmesi 64 kHz yapışma ve yayılma ile ilgili bilgiler sağlar. Yapışma olduğu(2-8 saat arasında) kapasitans eğrisinde itial plato fazı. , Elektrot kapsama doğrusal bir ilişki içinde olan, Yayılma eğrisinin eğimi tarafından temsil edilmektedir ve tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak 10-30 saat sonra tamamlanır. Zaman noktası t 1/2 (yarım maksimal kapsama) istatistiksel analiz için kullanılabilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. Şekil 4. Birleşik bariyer karakterizasyonu. Farklı pasaj numaraları (geçit 3 ve 6) jelatin kaplı 8W1E dizileri üzerinde tohumlandı ve bir MFT ölçüm EC bariyer. A) Direnç karakterize etmek için 30 saat boyunca uygulandı olan iki MVEC vericiler ölçümler, küçük verici 1 ca daha yüksek bir dirence sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Ca göre 11.000 Ω. Yaşlı vericiden 2. BC) ECIS ve modelleme yetenekleri 7.500 Ω düşük direnci için nedenini bulmak için kullanılır olmuştur. Modelleme benzer bir hücre-hücre etkileşim Rb ortaya ve olası bir nedeni. D gibi zayıf bir hücre-matris etkileşim Alpha gösterilen) RTC eğri altında kalan alan mikro-orantılıdır Fourier transformasyonu ile birleşik hücre tabakası içinde mikro-ölçmek için gerçekleştirildi . Spektrumları analizleri eski vericinin 2 daha az MicroMotion gösterir ve böylece zaten direnç sinyali (daha az varyans) den kabul edilebilir ne destekliyoruz. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. 5 "fo: İçerik-width =" "fo: src =" 5in / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/> Şekil 5,. Hücre göçü, elektrik yaralanmalar ve trombin stimülasyon sonrası etkileri. Empedans kayıtları maksimum zamansal çözünürlüğe sahip 4 kHz'de yapıldı. A) MVEC verici 1 geçişi 3 ve jelatin kaplı 8W1E diziler üzerinde geçit 6 verici 2 'de kullanılmış ve konflüansa büyütülmüştür. Sonra bir elektrik yara 20 sn her bir süre ile 60 kHz iki 5 V darbeleri uygulama tarafından oluşturuldu. Genç donör 1 HUVEC jelatin kaplı 8W10E diziler üzerinde yetiştirilmiştir) eski vericinin 2. B kıyasla daha hızlı bir yara kapatma (göç, eğriler yamaçlarında) dayalı yetenekleri iyileşme daha iyi yara ve yaralama sonra daha yüksek bir direnç gösterdi. Birbirine kaynaşma üzerine, hücreler bazal serum ortamı artı% 1 insan serum albümini (HSA) ile tam kültür ortamının değiştirilmesi ile 1.5 saat süre ile aç edilmiştir. Bizeserum bileşenleri trombin tepkisini blok beri HSA ile düz orta yaş, kritik bir adımdır. En kısa sürede sabit bir direnç plato olarak tespit edildi, trombin oyuklara direkt olarak ilave edildi ve 200 ul pipet ile dikkatli bir şekilde karıştırılır. Maksimal trombin etkisi başlangıca ve bir ca direnç geçici bir düşüş ile karakterize 30 dakika, sonra görünür. İyileştikten sonra% 30-50 daha düşük direnç. Hücreler ya 30 dakika ya da engelleyici için Rho kinaz engelleyici Y-27632 ile önceden kuluçkaya 20, 30, ya da hemen trombin etkisi azaldı trombin ilavesinden sonra 40 dakika ilave edildi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız .