Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Robert Szulcek; Harm Jan Bogaard; Geerten P. van Nieuw Amerongen

doi:10.3791/51300

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Bioengineering

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Published: March 28, 2014

doi:

10.3791/51300

Robert Szulcek¹, Harm Jan Bogaard¹, Geerten P. van Nieuw Amerongen²

¹Department of Pulmonary Diseases,Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center, ²Department of Physiology,Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center

Summary

Este protocolo revisa eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección, un método para registrar y analizar el espectro de impedancia de las células adherentes para la cuantificación de la unión celular, la proliferación, motilidad, y las respuestas celulares a estímulos farmacológicos y tóxicos. La detección de la permeabilidad endotelial y la evaluación de los contactos célula-célula y célula-sustrato que se obtienen.

Abstract

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección (IEM) es un sistema de medición de impedancia in vitro para cuantificar el comportamiento de las células dentro de las capas de células adherentes. Para este fin, las células se cultivan en cámaras de cultivo especiales en la parte superior de electrodos de oro, circulares opuestas. Una pequeña corriente alterna constante se aplica entre los electrodos y el potencial a través se mide. Las propiedades aislantes de la membrana celular crean una resistencia hacia el flujo de corriente eléctrica resultante en un aumento de potencial eléctrico entre los electrodos. Medición de la impedancia celular de esta manera permite el estudio automatizado de la unión celular, el crecimiento, la morfología, la función, y la motilidad. Aunque la medición de ECIS en sí es sencillo y fácil de aprender, la teoría subyacente es compleja y la selección de la configuración correcta y el análisis e interpretación de la información correcta, no es evidente por sí mismo. Sin embargo, un protocolo claro que describe los pasos individuales de la experimentaldiseño a la preparación, realización, y el análisis del experimento no está disponible. En este artículo el principio básico de medición, así como las posibles aplicaciones, se discuten las consideraciones experimentales, ventajas y limitaciones del sistema de ECIS. Se proporciona una guía para el estudio de la unión de células, la propagación y proliferación; cuantificación de comportamiento de las células en una capa confluente, con respecto a la función de barrera, la motilidad celular, la calidad de las adherencias célula-célula y célula-sustrato, y la cuantificación de la cicatrización de heridas y las respuestas celulares a los estímulos vasoactivos. Los resultados representativos se discuten basado en microvasculares humanas (MVEC) y células endoteliales de vena umbilical humanas (HUVEC), pero son aplicables a todas las células de crecimiento adherente.

Introduction

ΩΩΩHere presentamos eléctrico Cell-sustrato Impedance Sensing, conocida como ICE, un método específico para medir y analizar el espectro de impedancia de células adherentes en la cultura ^1. El objetivo de este protocolo es ofrecer una guía de aplicación general para el uso de este tipo particular de ensayos celulares de impedancia basada y proporcionar protocolos para algunas de las funciones clave de la constantemente creciente número de aplicaciones. La atención se centrará en el estudio de la proliferación celular, la función de la barrera, uniones de las células, y la motilidad celular.

Desde ECIS y su modelo asociado para transformar los datos de espectroscopía de impedancia en los parámetros relevantes biológicamente se introdujo en su forma actual a la comunidad científica por Giaever y Keese en 1991 ^2, a menudo se ha referido como un sistema para la medición de TEER (trans -epitelial resistencia eléctrica), que no es precisa. Las diferencias parecen marginal al principio, peroson importantes para la interpretación de los datos. Para las mediciones clásicas TEER, las células se cultivan en filtros permeables para caracterizar los mecanismos de transporte paracelular, dominados por uniones estrechas epiteliales o uniones adherentes endoteliales ^3. Comúnmente, dos electrodos colocados encima y debajo del filtro se utilizan para aplicar una corriente directa (DC) fluir sobre la capa de células y otros dos electrodos para medir la caída de voltaje resultante ^4. La resistencia eléctrica se calcula usando la ley de Ohm, que permite una descripción numérica de la calidad de la barrera de células.

ECIS sigue este principio básico y la amplía. En el sistema de ECIS, las células se cultivan en opuestos, electrodos de oro circulares que están incrustados en la parte inferior de platos especiales de cultivo de células. El número de electrodos por pocillo de cultivo es variable, depende de la aplicación y los electrodos tienen un diámetro estándar de 250 micras, y en algunos casos un contra-electrodo más grandese utiliza para completar el circuito. ECIS utiliza una corriente alterna constante (AC) de 1 μA con una frecuencia en lugar de una corriente determinada. La impedancia se calcula a partir de los correspondientes cambios en el voltaje (en mV) entre los electrodos. ECIS ofrece la posibilidad de medir la impedancia a través de una gama de frecuencias para estudiar las propiedades celulares dependientes de la frecuencia, que tiene varias ventajas sobre la TEER y se explicarán en detalle en este artículo. En primer lugar, la medición de la impedancia compleja permite la separación de la impedancia total en resistencia de barrera de células y la capacitancia celular. Además, por la toma de datos a múltiples frecuencias y la aplicación de un modelo matemático, se puede diferenciar entre la impedancia de la unión (estanqueidad de los contactos célula-célula) y la impedancia causada por las interacciones célula-sustrato (distancia de membrana de células basales a la matriz subyacente), así como la contribución de la capacitancia de la membrana celular. En segundo lugar, la proliferación celular y la motilidad pueden ser evaluados, ya que la células están en contacto directo con los electrodos. En tercer lugar, el sustrato y los electrodos son suficientemente delgada para permitir campo claro y microscopía de contraste de fase.

Bases de las mediciones de impedancia: La impedancia compleja

La base para la medición de la impedancia eléctrica de los objetos biológicos (por ejemplo, células) es la ley de Ohm, un principio electro-técnico básico, que describe la relación entre la resistencia (R), corriente (I) y la tensión (U) en un circuito eléctrico en un momento dado (t).
Aplicable en el circuito de DC: R (t) = U (t) / I (t)

Cuando se trabaja en el sistema de aire acondicionado, corriente y tensión, no sólo difieren en su amplitud, sino también en su fase (φ). Ahora, la resistencia ya no es suficiente para describir estas relaciones. En lugar de ello, la impedancia compleja (Z) o en la mayoría de los casos la magnitud de la impedancia (| Z |) se utilizan, que contiene la resistencia óhmica descrito anteriormente además de la reactancia (X), que reresultados de CA fluya a través de los condensadores y los inductores que impulsan el desplazamiento de fase entre tensión y corriente ^5.
Aplicable en circuito de CA: | Z (f) | = √ ^(R2 + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Para realizar las mediciones de impedancia en células intactas, debido a las características de su membrana, las células actúan como una conexión paralelo de la resistencia y el condensador. Aquí, la resistencia representa la oposición al flujo de corriente, mientras que la capacitancia (C) describe la separación de portadores eléctricos en la bi-capa de aislante de la membrana celular que causa la polarización de la célula. De este modo X está dominado por las propiedades capacitivas de la membrana celular.
X (f) ≈ (2 * pi * f * C _Celular) ^-1

Dado que X es dependiente de la frecuencia, la variación de la frecuencia de medición permite estudiar diferentes propiedades funcionales y estructurales de la célula. Los ECIS dispositivo mide tanto R y X, lo que permite el cálculode | Z |, C y φ.

La cuantificación de las capas de células enteras con espectroscopia de impedancia: El circuito eléctrico equivalente.

Como se explicó anteriormente, cuando una célula se pone en un campo eléctrico, que muestra propiedades de componentes electrónicos pasivos. Si ahora, en lugar de una sola célula, una capa de células toda crecido en la parte superior de los electrodos y suplementado con medio de cultivo celular se investigó, el modelo simple de la resistencia y el condensador necesita ser extendido a una red eléctrica entero. En este llamado circuito equivalente, deben ser considerados ^3,6 resistencia del medio de cultivo (R _Med), así como de la capacitancia (C _Electr) y la resistencia (R _Electr) la caracterización de la interacción de electrodo / electrolito.

Un ejemplo simplificado, general de tal circuito equivalente para una capa de células adherentes en crecimiento se puede encontrar en la Figura 1. La ventaja de un tal un matemáticoNFOQUE para describir un sistema biológico es que estos circuitos se pueden refinar ad libitum y se ajustaron a las preguntas experimentales específicas, por ejemplo, teniendo en cuenta la impedancia causada por orgánulos intracelulares o para distinguir las influencias de célula-célula (R _Junc) y las adherencias célula-sustrato (R _Sub) en ^7,8 general impedancia. Sin embargo, el objetivo para el modelado debe ser siempre para utilizar el menor número de elementos que describen todas las características del espectro de impedancia medida para permitir correlaciones significativas.

Figura 1. Esquema del sistema de ECIS y circuito equivalente representativa de una capa de células que crecen adheridas. A) Sección transversal de una cultura ECIS bien. Las células están creciendo en la parte superior de la detección y el contraelectrodo y unre cubierto con medio de cultivo. Los electrodos están conectados a un amplificador de bloqueo y en una señal de CA se aplica a través de una resistencia de 1 MW para crear una fuente de corriente constante. Los estímulos se pueden añadir directamente al medio de cultivo en cualquier punto en el tiempo las medidas de ECIS la suma de todas las contribuciones individuales a la impedancia. B). Resistencia del medio de cultivo (R _Med), así como la impedancia causada por la interfaz electrodo / electrolito, que es por simplicidad presentado como una combinación en paralelo de una resistencia (R _Electr) y un condensador (C _Electr), y también las propiedades eléctricas de la membrana celular, descrito por una conexión en paralelo de la resistencia (R _célula) y la capacitancia (C _MEM), todos necesitan ser considerados. R _célula es variable, ya que depende de la permeabilidad de la célula hacia la corriente. El circuito equivalente puede ser ampliado y refinado ad libitum. Como un ejemplo de la unión (R _Junc) comobien (R _Sub) la resistencia como subendotelial se añadieron al circuito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Parámetros de impedancia y su significado biológico

Los dos parámetros más directos derivados de las mediciones de impedancia son la resistencia y la capacitancia de las células. Resistencia representa la calidad y función de la barrera celular y por lo tanto, toma en consideración la resistencia hacia la para-y el flujo de corriente trans-celular. Capacitancia proporciona una medida general de la cobertura de electrodo. La característica distintiva de la ECIS es que con la ayuda de circuitos equivalentes y modelar los parámetros globales proporcionan información sobre muchas de las propiedades más celulares, incluyendo adherencias célula-célula y célula-sustrato, que se discutirá más adelante en este artículo.

Antes de comenzar: consi Experimentalraciones

Configuración de medición – La instalación consta de varios componentes diferentes: dispositivo ECIS con la electrónica de medición, PC para adquisición de datos, soporte de la matriz para el 8 – o sistema de 96 pocillos; arrays ECIS y el cultivo de células de elección. El titular de la matriz debe ser colocado en una incubadora y conectado al dispositivo de ECIS fuera de la incubadora. El PC necesita ser equipado con el software de ECIS (1.2.123.0 14 de febrero 2013) y conectado al dispositivo de ECIS.

Selección Array – Hay una variedad cada vez mayor de las matrices ECIS, diseñado para múltiples aplicaciones. Las matrices estándar son la 8W1E y las matrices 8W10E, que se compone de 8 pocillos de cultivo (indicado por W) que comprende 1 o electrodos de medición 10 (indicadas por E), respectivamente. Una gran contraelectrodo completa el circuito, pero su impedancia es esencialmente insignificante en la medición real ^6. El titular de la norma matriz de 8 pocillos puede albergar dos alrrays, lo que resulta en un número total de 16 pocillos de cultivo. Los electrodos de oro son 50 nm de espesor, delineada con una película aislante y montado en ya sea un sustrato de policarbonato Lexan ópticamente transparente o una placa de circuito impreso (PCB). Los arrays de PCB son más robustos y de coste económico. Las diapositivas transparentes permiten la luz y microscopía de inmunofluorescencia. Lo que debe tenerse en cuenta es que la matriz 1E aumenta las fluctuaciones en la señal de la resistencia causada por los movimientos celulares y es necesario para los estudios de cicatrización de heridas. Además, los electrodos individuales permiten la correlación de las señales eléctricas y ópticas. En las matrices de electrodos múltiples, la señal se promedia durante varios electrodos, que debido a la mayor área de medición incluye más células en la medición, limita el sesgo de los datos por inoculación desigual y el crecimiento de las células y reduce la borrosidad de la señal debido a la celda mociones. Por lo tanto, las matrices de electrodos múltiples son útiles para estudiar la proliferación celular y la formación de la barrera. Al lado dematrices estándar no son matrices especiales disponibles para la aplicación de la tensión de cizallamiento ^9, para estudiar la quimiotaxis ^10, la migración celular y la proliferación, así como placas de 96 pocillos para pruebas de detección de alto rendimiento. Para concluir, la matriz que se utilizará depende en gran medida cuestión científica y el tipo de células y debe ser seleccionado y probado cuidadosamente.

Frecuencia de medición – El modelado de Rb y alfa (ver análisis de datos) requiere medidas de frecuencia múltiple (MFT). De lo contrario, la impedancia se puede medir con el tiempo en un tipo de célula frecuencia específica (SFT), con la ventaja de que los datos pueden ser recogidos con una resolución temporal más alta. La frecuencia de medición más sensible para un tipo celular específico se puede encontrar escáneres de frecuencia. Al trazar la impedancia respectivamente la resistencia frente a la frecuencia en un logarítmico de la frecuencia en la que la diferencia entre libre de células y electrodos de cubiertas es mayor es la frecuencia en la que las células bloquean tél actual más eficaz. En el caso de las células endoteliales (CE) esta frecuencia es de aproximadamente 4 kHz.

Densidad de siembra – Como en toda la densidad normal experimento de siembra basado en células depende del problema científico. Cuando el estudio de la adhesión y la propagación o la formación de barrera, las células endoteliales deben ser sembradas con una alta densidad de 40.000-60.000 células / cm ² para garantizar un confluente, barrera estable después de 48 h. Si es el foco del experimento sobre la proliferación, las células endoteliales deben ser sembradas con una baja densidad de alrededor de 2.000-10.000 células / cm ^2.

Protocol

1. Preparación de Sistema de Medición Precalentar el titular de la matriz en una incubadora a 37 ° C antes de comenzar el experimento para evitar la condensación. Rellene el ataúd de agua de la incubadora con agua destilada para evitar la desecación de los pozos. Realizar todas las manipulaciones en las células y las matrices en una cabina de flujo laminar en condiciones estériles. 2. Preparación de matrices y la inoculación de las células NOTA: Los arreglos ECIS necesitan ser limpiados y estabilizado antes de un experimento para prevenir la deriva de la sonda, para mejorar la reproducibilidad acomodado bien y la relación señal-ruido. Por lo tanto hay dos opciones disponibles: A) pretratamiento de los electrodos con L-cisteína y B) la función de estabilización de la ECIS. Opción A: L-cisteína se recomienda como tratamiento previo más consistente, pero que en algunos casos especiales interactuar con el recubrimiento de proteínaGS en los electrodos. Los volúmenes presentados se utilizan para las matrices de 8 pocillos estándar. Añadir 200 l / pocillo de 10 mM de L-cisteína. Cisteína limpia y modifica la superficie del electrodo que proporciona una capacidad alta y reproducible electrodo. Incubar 15 min a temperatura ambiente (RT). Lavar dos veces 500 l / pocillo con agua ultrapura (tipo 1). No utilice tampones de fosfato, que pueden interferir con la adsorción de algunas proteínas. También evitar las soluciones que contienen suero antes del revestimiento, ya que la superficie de oro se adsorberá los primero macromoléculas ponen en contacto. Escudo con 200 l / pocillo tibia 1% de gelatina. Incubar 30 min a 37 ° C. Retire la gelatina, pero no dejes que la superficie se seque. Esto puede dañar los electrodos. Lavar una vez con agua ultrapura (tipo 1). Añadir 400 l / pocillo de medio de cultivo celular completo (que contiene suero, antibióticos y todos los factores de crecimiento). Matriz en el soporte de diapositivas Arrayd asegurarse de que la matriz se coloca de tal manera que los nueve cojines cuadrados de oro son contactados correctamente por los pasadores pogo resorte y tornillo de ajuste de corrección mano apretada. Tenga cuidado con las matrices transparentes, la capa de oro puede dañarse fácilmente. Abra el software de medición y pulse Configuración seguido de verificación de la sección "Recoger datos" para realizar una medición de la impedancia rápida de cada pozo individual. Los valores resultantes son la base de referencia de medición y se guardarán automáticamente en la sección "Comentarios". La verificación también determinará automáticamente el tipo de matrices ECIS utilizado. Verifique los arreglos seleccionados en la sección "Bien Configuración". El diagrama de matriz se ilumina en verde para los pozos conectados correctamente y rojo para los pozos conectados vacíos o incorrectos. Sin embargo, asegúrese siempre de que los arreglos fueron colocados correctamente en el soporte. NOTA: Si la limpieza y revestimiento tuvieron éxito los arrays 8W1E ECIS tienen acapacitance de aproximadamente 5 nF y las matrices 8W10E de 50 nF, lo que resulta en una resistencia de línea de base de aproximadamente 2000 y 200 Ω, respectivamente. Retire matriz a partir de soporte. Células de semillas como una suspensión de células en 400 l / pocillo completa medio de cultivo celular. Opción B: La función de estabilización de los ECIS se puede utilizar como una alternativa o en combinación con el tratamiento con L-cisteína y si se producen problemas con la deriva de la sonda o grandes diferencias en la resistencia-pocillo a pocillo y la capacitancia. Realizar el tratamiento de cisteína (opcional) y electrodos para la capa filtrante con la proteína (opcional). Añadir 200 l / pocillo de medio completo a cada pocillo y colocar la matriz en el soporte de matriz. Software de medición Abrir y pulse Configuración seguido de Check para determinar la matriz está correctamente conectado y medir inicial Z, R y C. Estabilizar los electrodos pulsando <strong> Estabilizar en la sección "Recoger datos". El ECIS se aplicará una corriente elevada (ca. 3 mA), de alta frecuencia (64 kHz) de pulso para limpiar los electrodos. Compruebe de nuevo los electrodos. Capacitancia debe incrementarse y los valores de resistencia debe estar en un rango comparable. Si los valores de capacitancia y resistencia todavía no son satisfactorios, repita la estabilización. Retire matriz del soporte e inocular células. 3. Configuración de Software Medición y Adquisición de Datos Coloque la matriz en el soporte de matriz como se ha descrito antes. Software de medición Abrir y presione el botón Configuración en la sección "Recoger datos" para conectar el software ECIS al instrumento ECIS y ejecutar otro pozo Check. Verifique los arreglos seleccionados en la sección "Bien Configuración". Seleccione los pozos a ser medidos en el "Bien CONFIGURACsección de iones ". Seleccione el modo de medición de los "recoger datos" Opciones: Para una serie de tiempo a una frecuencia fija, seleccione Frecuencia Única. / Hora (SFT) y seleccione la frecuencia de medición del menú desplegable. Para la medición de la cobertura de los electrodos y el modelado de Rb y Alpha, seleccione Frecuencia Múltiple. / Hora (MFT). El dispositivo ECIS medirá automáticamente en todas las frecuencias disponibles. Para micromovimientos (véase el análisis de datos), seleccione Rápido Tiempo Collect (RTC) y ajustar la frecuencia de la medición y la frecuencia de muestreo. Aquí la resolución temporal estándar es de una muestra por segundo (1 Hz), pero la frecuencia de muestreo también se puede aumentar para seguir los cambios rápidos en la impedancia hasta 25 Hz (para el Z-theta). Nota importante: en modo RTC sólo se mide un solo pozo. NOTA: Si necesita micromovimientos que medirse en varios pozos posteriormente, vaya a Ayuda> Artículos de la barra de herramientas Mostrar experto / menu> Adquire> Multi-Bueno RTC. Especificar el límite de tiempo (h) en la sección Recopilar datos, el ECIS ahora medirá los pozos seleccionados en orden numérico. Después de iniciar la medición, el software le pedirá que especifique el número de ciclos. Introduzca el valor de la frecuencia necesita la medición debe repetirse. Para SFT y MFT, seleccione el tiempo de intervalo (segundos) entre las mediciones o si necesitan datos a adquirir lo más rápido posible dejar esta opción sin marcar. NOTA: para obtener datos del dispositivo ECIS utiliza un multiplexor para cambiar de un pozo a otro con una velocidad de adquisición de SFT mínimo de 0,25 segundos y 7,5 segundos para el MFT. Significado del intervalo depende de la cantidad de pozos y las frecuencias seleccionadas. Para las mediciones en las células proliferantes lentas o un simple registro de la resistencia en función del tiempo, utilice intervalos de 600 segundos o más. Pulse Inicio, el nombre del archivo y seleccione la ubicación para almacenar los datos. NOTA: El tamaño del archivo no debe ser un problema, ya que los datos ECIS se guardan en un tipo de formato de texto plano llamado *. ABP, que nunca supera los varios cientos de MB, incluso con todas las frecuencias de medición y número de pozos seleccionados. Deje de correr pulsando en Finalizar. 4. Cambio medio y la manipulación de células Presione Pausa, esto detendrá la adquisición de datos, pero seguirá funcionando el reloj experimental. Retire el conjunto del soporte y manipularlo bajo una cabina de flujo laminar (es decir, medio de cambio). Coloque la matriz y de nuevo en el soporte, ya sea haga clic en Comprobar conexión o reanudar Experimento para continuar la adquisición de datos. El software de medición colocará una marca de tiempo en el conjunto de datos. 5. Agudo Estimulación Durante Adquisición de Datos NOTA: Una segunda opción es manipular las células durante la adquisición de datos para seguir los cambios inmediatos. Esto sólo es posible; Cuando las muestras no tiene que ser estéril en el curso ulterior del experimento. Añadir el estímulo directamente a la fuente y asegúrese de mezclar cuidadosamente con una pipeta de 200 l. Punto de marca de tiempo de forma manual pulsando Marcar y añadir un comentario. 6. Electrical Herir NOTA: encontrar la configuración correcta para el tipo de célula utilizada es clave para herir eléctrica. Si hiriendo es demasiado corto esto puede resultar en la eliminación insuficiente de las células, mientras que si la herida es demasiado largo y / o áspera que esto puede dañar los electrodos (especialmente en las matrices transparentes). Por lo tanto, se recomiendan varios pulsos cortos hirientes. Para los cultivos de HUVEC dos pulsos de larga hirientes 10-20 seg de 5 V a 60 kHz cada uno se han encontrado óptima utilizando el ECIS 1600R. En general, se recomienda el uso de altas frecuencias> 20 kHz a mantener altos campos uniformes a través de las células y para evitar cualquier daño a los electrodos. Realice hiriendo during una medición ECIS activo. Habilitar Herida / Configuración electroporar, a continuación, en la herida y llenar el tiempo (segundos), la tensión de la herida (V durante 1600 R) o corriente (μA para Z y Z-Theta) y frecuencia (Hz). Los valores por defecto que se muestran se basan en el tipo de matriz y el dispositivo de ECIS. Seleccione los pozos de la herida en la sección "Bien Configuración". Sólo serán heridos los pozos controlados. Habilitar Retrasar hasta Hora y rellenar el tiempo de retraso para activar la función de retardo de la herida. Esta función se puede detener en cualquier momento pulsando Parar o la aplicación de una herida de forma manual. Sólo un comando de retardo puede estar activo a la vez. Pulse Activar y haga clic en Aceptar en la ventana emergente para iniciar la herida. Asegúrese de que la señal de resistencia baja a la impedancia de desplazamiento después de la herida, de lo contrario repetir la herida. 7. Análisis de Datos </p> Representación de datos y exportación. Finalizar la medición o datos de carga establecido a través de File -> Open. Seleccione los pozos que se mostrarán en la ventana "Configuración Well". Pozos individuales grupo que presente la media. Elija el parámetro que se mostrará en la barra de herramientas superior (Z, R o C). Seleccione el tipo de gráfico de la barra de herramientas superior (T = tiempo, F = frecuencia, blot 3D = catarata). Definir desplazamiento gráfico y rango con los deslizadores debajo de la ventana gráfica o rellenar los valores exactos en los controles adyacentes. Elige entre las básicas "Opciones de Series de Tiempo" en la sección "Analizar" para llevar a cabo la desviación estándar, corriendo promedio o normalización de los datos. Activar Toolbar Experto en el menú Ayuda para las operaciones más avanzadas como Nyuist parcela y la transformación de Fourier. Utilice "Opciones de pantalla" en la sección "Analizar" para definir raESN de x e y ejes y exportación de gráficos. Exportación de datos seleccionados a un archivo de Excel a través de Archivo -> Exportar datos -> Para Excel (Seleccionado) y utilizar un software de terceros de elección para un análisis en profundidad, las estadísticas y la representación, según sea necesario. Modelado de Rb y Alpha. NOTA: Para el modelado, se recomienda utilizar un libre de células, medio lleno, así como referencia. Medición MFT Finalizar o la carga conjunto de datos MFT. Si un pozo de referencia libre de células es la prensa disponibles ya sea en Buscar para seleccionar automáticamente el valor de referencia o Set para seleccionar el punto de tiempo libre de células manualmente desde "Freq. Scan Modeling" en la sección "Análisis". Si no hay ninguna referencia libre de células, importar un valor de referencia a partir de otro conjunto de datos. Abra el conjunto de datos de referencia (asegúrese de que se utilizó la misma matriz y medio) y utilizar la función Buscar o Set para seleccionar el valor de referencia.A continuación, vaya a los datos medidos y pulse Get. Si no hay datos de referencia libres de células establecidas uso disponible de fábrica. Presione Modelo para iniciar los cálculos. Modelado puede tardar varios minutos dependiendo del tamaño del conjunto de datos. Cálculo de micromovimiento. NOTA: Este cálculo no es parte del software de medición, pero se puede realizar con cualquier software de procesamiento de señal. Terminar la medición RTC o cargar conjunto de datos RTC. Normalizar establecidos por la resistencia promedio de todo el período de datos. Romper establecidos en segmentos con una longitud de 256 puntos de datos de datos y limpiar cada segmento por una ventana de Hanning. Ejecutar una transformación de Fourier de 256 puntos y el promedio resultante espectros de frecuencia de un espectro de potencia 129 puntos de una sola cara para minimizar el ruido aleatorio y mejora la señal biológica. Frecuencia de complot contra la amplitud en un gráfico logarítmico y aplicarajuste lineal de mínimos cuadrados. La pendiente del ajuste lineal es una medida de ruido total en la señal y de ese modo el micromovimiento de las células.

Representative Results

La creación de un experimento es bastante simple y la medición en sí es totalmente automático, pero como suele ser el caso, el análisis y la interpretación de los datos correctos son cruciales. En la sección de datos representativos se proporciona una guía para la interpretación de los parámetros más importantes que ofrece la espectroscopia de impedancia con ECIS. Esto será útil para decidir para qué tipo de problema científico una medición ECIS puede ser útil y qué parámetros deben ser registradas. Un experimental típica de lectura-a cabo en general se puede dividir en una fase de crecimiento después de la inoculación de células y una meseta de fase cuando las células alcanzan la confluencia. Cada una de estas fases aporta información sobre diferentes propiedades celulares. Una medición representativo se muestra en la Figura 2 y se divide en cuatro subfases para analizar A) la adhesión celular, propagación y proliferación, b) formación de una barrera CE maduración; C) la migración de células después de la generación de un eléctricaal enrollado, y d) la respuesta celular a la estimulación con la trombina agente vasoactivo. Contraste de fase y de inmunofluorescencia imágenes fueron adquiridas directamente desde el electrodo de medición durante las diferentes subfases para ilustrar la relación entre la cobertura de los electrodos, estado de las células, y la señal de impedancia de grabado. La adhesión, la propagación y proliferación Cada tipo de célula tiene su característica de adhesión y el crecimiento curva que puede ser manipulado mediante la variación de la densidad de siembra, recubrimiento con proteínas de la matriz extracelular o otros estímulos. Una de las principales dificultades para estudiar los procesos es diferenciar entre la adhesión, la propagación y proliferación. Wegener et al 11. Dio una descripción detallada para el uso de una combinación de resistencia y capacitancia para distinguir entre esos parámetros y en la Figura 3 se hace evidente cómo la resistencia y la capacitancia pueden complementarse entre sí. Es importante que losel estudio de la adhesión y la propagación de comprender la influencia de la frecuencia de medición, porque aquí el campo eléctrico provoca una polarización de la membrana celular de las células en suspensión 8, lo que obliga a que la corriente fluya exclusivamente alrededor de las células. Cuando las células se adhieren empiezan a restringir el flujo de corriente por la difusión en los descensos de los electrodos y de la capacitancia de una manera lineal con el porcentaje de área abierta en el electrodo (área fraccional). Por lo tanto, la adhesión, la propagación y la proliferación se pueden cuantificar mejor, cuando se graba la capacitancia a una frecuencia superior a 40 kHz (Figura 3B), donde la disminución de la capacitancia es directa proporcional a la cobertura de electrodo. Alternativamente resistencia en su más sensible frecuencia de medición es una medida directa para la diferenciación y maduración de las células en una barrera confluentes (Figura 3A). Además del área fraccional, Wegener et al. Introdujo otros dosparámetros para cuantificar la adhesión y la cobertura de electrodo: t 1/2 (la mitad del máximo de la capacitancia), que es el tiempo hasta el 50% del electrodo se cubre con las células (Figura 3B, de inserción), y la pendiente de la curva de capacitancia (s, no se muestra) como la tasa de propagación de células y la proliferación. Resistencia como una medida de la calidad de barrera La resistencia es la parte de la impedancia que describe la calidad y la función de barrera mejor, porque descuida componentes capacitivos de membrana, electrodo y medio. Aquí se utiliza la calidad barrera plazo y no permeabilidad, ya que la permeabilidad es, por definición, sólo depende de los contactos célula-célula. Resistencia sin embargo se determina por la capacidad de las células y sus interacciones célula-célula y célula-matriz para bloquear el flujo de corriente. De acuerdo con ello diferentes tipos de células (clones y pasajes) tienen sus valores de resistencia específicos (Figura 4A). Aunque la resistencia da una mucho CLEAidea de TCR sobre la barrera de células, la señal de impedancia siempre debe ser tomada en consideración. Modelado de Rb y Alpha El software ECIS alberga una característica particular, la capacidad de modelar dos parámetros, que distinguen entre las adherencias célula-célula y célula-matriz (Figuras 4B y 4 C). Rb (en cm 2 x ohmios), es la resistividad de los contactos célula-célula para el flujo de corriente y por lo tanto una medida inversa de la permeabilidad clásica. Alta Rb implica una baja permeabilidad hacia el flujo de corriente. Alfa (en cm x 0,5 ohmios), es una medida para las contribuciones de impedancia resultantes de las uniones célula-electrodo. El modelo para cuantificar los contactos célula-célula y célula-matriz se introdujo 1991 por Giaever y Keese y se basa en la suposición de que las células son circulares, objetos en forma de disco que tengan la membrana aislante, se ciernen sobre el electrodo y están llenos de electrolito conductor 2 . Lala propiedad de la membrana celular aislante deja sólo tres vías para la corriente de: a) entre la superficie ventral de las células y el electrodo, b) entre los contactos célula-célula, y c) a través de las células sólo es probable cuando se utiliza una alta frecuencia de medición ( ). Una derivación y explicación más detalladas se pueden encontrar en los papeles de Lo et al 3,12. Micromotion Se ha demostrado que pequeñas fluctuaciones en la señal de resistencia (Figura 4A) se deben a movimientos de la célula, al azar sutiles en capas de células confluentes, así como células que se desplazan dentro y fuera del electrodo en cultivos dispersos 2. Este aspecto de los datos de tiempo-por supuesto ECIS descritos por Lo y Opp et al 13,14. A menudo se pasa por alto y se ve mejor cuando se mide con los 1E matrices y con la frecuencia más sensible para dar cuenta de los actuales senderos subcelulares para-y. El cálculo de esta célula causada ruido (micromovimiento) no es parte de the software de medición estándar, aunque en la versión más reciente está integrado Transformación Rápida de Fourier (FFT). Grabación de datos RTC con una frecuencia de muestreo de 1 Hz durante 1 hora a 4 kHz proporciona suficiente resolución para el cálculo de micromovimiento CE. Este cálculo proporciona un valor único y se puede utilizar directamente para el análisis estadístico. Una extensa discusión sobre el uso del análisis de frecuencia para micromovimiento se puede encontrar en otro lugar 15. Alternativamente a la FFT otras estrategias de análisis se pueden utilizar, al igual que la varianza de los incrementos. La varianza es más sensible a pequeños cambios en el micromovimiento, pero debido a esta sensibilidad a la comparación de experimentos individuales se hace difícil. Las laderas del espectro de potencia son una medida más robusta de micromovimientos (Figura 4D). Aquí, el área bajo la curva puede ser visto como la cantidad de micromovimiento o ruido de las células crean. Por lo tanto, cuanto más pronunciada es la pendiente del espectro de potencia menor es el área bajo la curvay el más pequeño es el micromovimiento. Ensayo de cicatrización de la herida eléctrico Para el estudio de la migración de las células, por lo general las heridas mecánicas se aplican al rascarse las células de la placa de cultivo de puntas de pipeta, raspadores de células o sellos específicos y seguir su remigración microscópicamente 16. Este método tiene la desventaja obvia de que el tamaño de la cero varía y es por lo general demasiado grandes para pasar por alto la influencia de la proliferación celular en el proceso de cicatrización de la herida. La función hiriendo del ECIS utiliza un alto voltaje y alta frecuencia de pulso para obtener un electrodo libre de células y, posteriormente sigue remigración de las células vecinas para reemplazar las células muertas (Figura 5A). Una ventaja de este método automatizado más, los ensayos de cero mano de obra intensiva estándar es que el ECIS produce una herida altamente reproducible con un diámetro preciso de 250 micras, que se cierra dentro de unas pocas horas, para estudiar la migración pura. Además, el impulso eléctrico haceres no quitar capa de proteínas y la matriz extracelular secretada. Bajo el supuesto de que las células Vuelva a migrar en el electrodo desde todos los lados, la tasa de migración fácilmente se puede calcular dividiendo radio de la herida por el tiempo requerido para el cierre de la herida 17. Como una alternativa a la herida eléctrica, recientemente el llamado método de valla eléctrica se introdujo (no mostrado). Aquí altos pulsos de corriente de impedir la adhesión y migración de las células en los electrodos después de la inoculación. Las células crecerán en todo el electrodo de medición y empezar a migrar hacia el interior, tan pronto como los pulsos eléctricos están apagados. La ventaja de la valla eléctrica sobre la herida eléctrica es que la superficie del electrodo no ha sido alterado por un crecimiento celular o la eliminación de células, lo cual es importante para medir las influencias de diferentes recubrimientos sobre la migración celular. La estimulación celular Además del estudio de la migración celular, espectroscopia de impedancia se adapta perfectamente amedir los efectos de los fármacos y toxinas en las células. Figura 5B presenta un experimento de estimulación / inhibición clásica, donde se usó trombina para inducir hiper-permeabilidad en la barrera CE confluentes por la contracción y la brecha de formación de las células, que se manifiesta como una disminución transitoria en la resistencia . Por la preincubación con el inhibidor de quinasa Rho Y-27632 la mayor parte de la respuesta de la trombina se ve disminuida por la disminución de la tensión de célula basal 18 y el bloqueo de la formación de fibras de estrés 19. Entonces se utilizó el bloqueador de quinasa Rho a diferentes puntos de tiempo después de la adición de trombina, dando lugar a una recuperación inmediata y total de la barrera CE. Aquí la ventaja de un sistema de medición continua de la impedancia para estudiar respuestas celulares agudas se hace evidente. En los ensayos de punto final regulares (por ejemplo, tinción de inmunofluorescencia o de paso macromolécula), esta respuesta aguda a la bloqueante utilizado sería muy difícil, si no imposible de detectar y cuantificar. Importante tener en cuenta es que con imediciones mpedance la permeabilidad hacia los iones se describe y no hacia macromoléculas. Por favor refiérase a Aman et al. 20, donde se ofrece una excelente comparación entre las mediciones y experimentos ECIS paso macromolécula. Figura 2. Medición Representante. MVEC se cultivaron en una gelatina recubierto arrays 8W1E con una densidad de siembra de baja de 5000 células / cm 2 y el registro MFT se realizó durante 10 días. La medición ilustra los diferentes lectura de los un experimento ECIS: A) de adhesión, propagación y proliferación, b) formación y maduración de una barrera celular confluente; C) la curación de heridas después de la aplicación de una herida eléctrica; D) la estimulación con el vasoactivo trombina agente. Las dos flechas indican medio refrescos, que se realizaron en intervalos de 4 días y dan una idea de la sensibilidad de las mediciones a los estímulos mecánicos y los cambios en la temperatura y el pH. Las imágenes en el panel superior corresponden a la medición y se adquirieron directamente desde el electrodo de medición. La imagen de contraste de fase de la izquierda muestra las células endoteliales 24 h después de la inoculación, empezando a cubrir el electrodo. Las imágenes de inmunofluorescencia en el centro y de la derecha presente tinción de actina F de la capa endotelial confluentes antes y después de la estimulación con trombina (1 U / ml). La trombina provoca la contracción de las células endoteliales por la formación de las denominadas fibras de estrés y la apertura transitoria de espacios entre endoteliales (flechas e insertos de imágenes), reconocibles en la señal de ECIS por una caída en la resistencia a la línea de base. Aquí la sensibilidad de la medición se hace evidente y cómo los cambios en la capa de células se correlaciona con la señal de impedancia.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. La unión celular y el crecimiento. MVEC del mismo donante se sembraron con tres densidades diferentes en recubiertos con gelatina matrices 8W10E y el crecimiento celular se registró a múltiples frecuencias para 60 h. A) Los valores de resistencia para las tres condiciones en su frecuencia óptima de 4 kHz para medir formación de la barrera. Todos los tres densidades de siembra establecieron una barrera confluente de CA. 1200 Ω en el final de la medición;. Las tasas de proliferación sin embargo (pendientes de las curvas) difieren marcadamente B) Medición de la capacidad a 64 kHz proporciona información detallada sobre la adhesión y la propagación. La adhesión es el defase de meseta itial en la curva de capacitancia (entre 2-8 horas). Difusión, que está en relación lineal a la cobertura de electrodo, está representada por la pendiente de la curva y se completa después de 10-30 horas, dependiendo de la densidad de siembra. El punto t 1/2 (cobertura de la mitad del máximo) se puede utilizar para el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Caracterización de la barrera confluente. Dos donantes MVEC con diferentes números de paso (paso 3 y 6) fueron sembradas en matrices de gelatina recubierta 8W1E y una medición de la MFT se llevó a cabo durante 30 horas para caracterizar la barrera CE. A) Resistencia mediciones revelan que el donante más joven 1 tiene una mayor resistencia de CA. 11.000 Ω en comparación con el ca. 7500 Ω del donante más 2. C.) Las capacidades de modelado de la ECIS se han utilizado para encontrar la causa de la menor resistencia. Modelado reveló una Rb interacción célula-célula comparable y se indica una interacción célula-matriz debilitada Alfa como una posible causa. D) RTC se realizó para cuantificar el micromovimiento dentro de la capa de células confluentes por transformación de Fourier, donde el área bajo la curva es proporcional a micromovimiento . Los análisis de los espectros muestran menos micromovimientos del donante mayor de 2 y de esta manera apoyar lo que ya se puede suponer a partir de la señal de la resistencia (menor varianza). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/> Figura 5. La migración celular después de la herida eléctrico y efectos de la estimulación de la trombina. Grabaciones de impedancia se realizaron a 4 kHz con resolución temporal máxima. Una) MVEC donante 1 se utilizó en el paso 3 y de los donantes 2 en el paso 6 en recubiertos con gelatina matrices 8W1E y crecer hasta la confluencia. Entonces una herida eléctrica fue creado por la aplicación de dos pulsos de 5 V a 60 kHz con una duración de 20 segundos cada uno. El donante más joven 1 mostró mejor herida capacidades basadas en un cierre de la herida más rápido (la migración, pendientes de las curvas) de curación y una resistencia superior después de la herida en comparación con el donante más viejo 2. B) Las HUVEC se cultivaron en las matrices de gelatina recubierta 8W10E. Tras la confluencia las células se han suero de hambre durante 1,5 horas mediante la sustitución del medio de cultivo completo con medio basal más 1% de albúmina de suero humano (HSA). Nosotrosla edad del medio natural con HSA es un paso fundamental, ya que los componentes del suero bloquean la respuesta trombina. Tan pronto como se detecta una meseta resistencia estable, se añadió trombina directamente a los pocillos y se mezcla cuidadosamente con una pipeta de 200 l. El efecto de trombina máxima es visible después de 30 min, se caracteriza por una caída transitoria en la resistencia a la línea de base y una CA. Resistencia a un 30-50% más baja después de la recuperación. Las células se incubaron previamente, ya sea con la quinasa bloqueador de Y-27632 Rho durante 30 minutos o el bloqueador se añadieron 20, 30 o 40 min después de la adición de trombina, lo que disminuyó el efecto de la trombina inmediatamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra .

Discussion

ECIS es una excelente herramienta para el cribado de las propiedades de celda y comportamiento, así como para la cuantificación de los efectos de las sustancias conocidas y desconocidas. De este modo las células se llevan a cabo bajo condiciones de cultivo estándar, impedancia continua se puede controlar con una alta resolución temporal y correlacionadas a las señales ópticas. De esta manera el punto de tiempo óptimo para manipulaciones de células puede ser elegido sobre la base de la situación celular morfológica y funcional. Desafortunadamente, esta alta resolución de la medición viene con el precio que pequeños cambios en la temperatura, el pH o la estimulación mecánica de las células (cambio de medio) influirán en la señal de impedancia inmediatamente.

La aplicación de la corriente de medida pequeña a las células hace que la medición no invasiva de ECIS, no destructivo, y libre de marca, pero como resultado sólo las propiedades bioeléctricas pasivas se puede medir (sin potenciales de acción). Una característica clave es que una serie de parámetros puede ser der IVED a partir de una sola medición, la combinación de la información de varios ensayos clásicos, como la permeabilidad o ensayos de curación de heridas. Aquí el aspecto particularmente interesante es que los datos modelados matemáticamente se pueden utilizar para explorar cambios en la resistencia y la capacitancia y se refieren a estructuras celulares distintos (por ejemplo, teléfonos-contactos o de la membrana celular). Es importante señalar que la espectroscopía de impedancia siempre proporciona una señal de un promedio de todas las células en el electrodo de detección, que no permite a los estudios sobre las células individuales y también el modelo matemático es válido solamente en las capas de células confluentes. Por lo tanto, las células endoteliales se celebren en el estado confluente durante al menos un día antes de que se utiliza para el modelado para asegurar celulares adherencias maduros y células en reposo. Igualmente, las heridas eléctricas sólo deben ser aplicados a las capas de células confluentes mediante múltiples pulsos hirientes cortas con frecuencias altas, para lograr la eficiencia óptima heridas y prevenir el daño de los electrodos.

jove_content "> Para obtener la máxima cantidad de información a partir de una medición de ECIS, como en cada ensayo, varios parámetros, tales como la combinación de sustrato matriz, recubrimiento y densidad de siembra para el tipo de célula individual necesitan ser probado y optimizado antes de un experimento.

Una limitación importante de ECIS es que la medición no proporciona información directa sobre el nivel molecular. Por lo tanto mediciones ECIS son generalmente más informativos en el comienzo de una serie experimental para ayudar a asociar un problema científico con estructuras o propiedades celulares y proporcionar una aportación significativa para la generación de una hipótesis comprobable. Por lo tanto, el diseño modular de ECIS ofrece una amplia gama de aplicaciones con la posibilidad de que a medida hecho arrays. Los últimos desarrollos de la matriz indican un futuro enfoque en pruebas de detección de impedancia de alto rendimiento para la proliferación celular y heridas eléctrica y el avance de las matrices de flujo especiales para la simulación de in vivo </em> tensión de cizallamiento con diferentes perfiles de flujo.

Además literatura
Por favor, consulte también la página web de Biofísica Aplicada (www.biophysics.com) para notas de aplicación, seminarios web y una lista detallada de las publicaciones que cubren todo el espectro de ECIS.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer al Dr. Charles Keese, Dr. Christian Renken, Christian Dehnert (Biofísica Aplicada Inc.) y el Dr. Ulf Radler (ibidi GmbH) por su asesoramiento, la ayuda y las discusiones fructíferas durante la preparación de este manuscrito. Además, nos gustaría dar las gracias a Jan van Bezu por su excelente apoyo técnico.

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Distributor Europe	Catalog Number	Comments/Description
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	71617	http://www.biophysics.com/products-ecisz0.php
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70004	http://www.biophysics.com/cultureware.php
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70001	http://www.biophysics.com/cultureware.php
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70010	http://www.biophysics.com/cultureware.php
L-Cystein	Merck Millipore	–	102838	http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/l-cystein/MDA_CHEM-102838/p_GLOb.s1L7V8AAAEWL.EfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=L-cystein&BackButtonText=search+results
Gelatin	Merck Millipore	–	104070	http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/gelatine/MDA_CHEM-104070/p_S7Wb.s1LadYAAAEWaOEfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=gelatine&BackButtonText=search+results
Bovine Thrombin	Merck Millipore	–	604980	http://www.merckmillipore.com/germany/life-science-research/thrombin-bovine-high-activity/EMD_BIO-604980/p__pmb.s1LNsYAAAEWS2IfVhTm?PortalCatalogID=merck4biosciences
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin	–		http://www.sanquin.nl/en/products-services/plasma-products/
Y-27632	Tocris Biosciences	–	1254	http://www.tocris.com/dispprod.php?ItemId=1382#.UbiFNNish8E
EGM-2 BulletKit	Lonza	–	CC-3162	http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/endothelial-cell-growth-media-kits.aspx
Pen/Strep	Lonza	–	17-602E	http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx

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Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility. J. Vis. Exp. (85), e51300, doi:10.3791/51300 (2014).

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