Электрический клетки с субстратом Сопротивление зондирования для количественной оценки эндотелиальной пролиферации, барьерную функцию, и Подвижность

Настройка эксперимент является довольно простым и само измерение является полностью автоматическим, но, как это часто бывает, правильный анализ и интерпретация данных имеют решающее значение. В разделе представительного данных руководство предназначен для интерпретации наиболее важных параметров, предусмотренных импедансной спектроскопии с ЕСНГ. Это будет полезно, чтобы решить, для какой вид научной проблемы измерения ЕСНГ могут быть полезны и какие параметры должны быть записаны. Типичная экспериментальная чтения из в целом можно разделить на рост фазы после введения клеток и плато-фазы, когда клетки достигают слияния. Каждый из этих этапов дает информацию о различных клеточных свойств. Представитель измерение показано на рисунке 2 и разделить на четыре подфаз проанализировать A) клеточную адгезию, распространение и распространение; Б) формирование созревания ЕС барьера; C) миграция клеток после генерации электрическойдр. раны, и D) клеточный ответ на стимуляцию с вазоактивного агента тромбина. Фазового контраста и иммунофлюоресценции изображения были получены непосредственно от измерительного электрода в разные подфаз чтобы проиллюстрировать связь между охватом электрода, состояние клеток и записанного сигнала импеданса. Адгезия, распространение и распространение Каждый тип клеток имеет свой характерный адгезии и роста кривую, можно манипулировать посредством изменения плотности посева, покрытие с белками внеклеточного матрикса или других стимулов. Одна из основных трудностей для изучения этих процессов для дифференциации адгезии, распространения и распространение. Вегенер и др. 11. Дал подробное описание для использования комбинации сопротивления и емкости, чтобы различать этих параметров и на рисунке 3 становится очевидно, насколько сопротивление и емкость могут дополнять друг друга. Важно, чтобыизучение адгезии и распространение понимать влияние частоты измерения, потому что здесь электрическое поле вызывает поляризацию клеточной мембране клеток в суспензии 8, что заставляет ток протекать исключительно вокруг клеток. Когда клетки приложить они начинают ограничивать ток, распространяя над электродом и емкости уменьшается по линейному закону с процент открытой площади на электроде (дробный область). Таким образом, адгезия, распространение и распространение может быть количественно лучшем случае, когда емкость записи на частоте, превышающей 40 кГц (рис. 3В), где уменьшение емкости является прямой пропорциональна покрытия электрода. В качестве альтернативы сопротивление на его самой чувствительной частоте измерения является прямой мерой для дифференциации и созревания клеток в сливной барьер (рис. 3А). В дополнение к дробной области, Вегенера и соавт. Введены два другихПараметры для количественной оценки адгезии и покрытие электрода: T 1/2 (половина максимальной емкости), который является время до 50% от электрода не покроется клетками (фиг. 3B, вставка), и наклон кривой емкость (с, не показаны), как скорость распространения клеток и пролиферации. Сопротивление в качестве меры качества барьера Сопротивление является частью импеданса, который описывает качество барьера и функцию лучший, потому что она не учитывает емкостные компоненты из мембраны, электродом и среды. Здесь качество термин барьер, а не проницаемость используется, так как проницаемость по определению зависит только от межклеточных контактов. Сопротивление однако определяется способностью клеток и их межклеточных и клетка-матрикс взаимодействий блокировать ток. Соответственно разные типы клеток (клоны и проходы) имеют свои специфические значения сопротивления (рис. 4а). Хотя сопротивление дает гораздо КлиоRER идея о клеточный барьер, сигнал сопротивление всегда должны быть приняты во внимание. Моделирование Rb и Альфа Программное обеспечение ЕСНГ таит в себе определенную функцию, способность моделировать два параметра, которые отличают между межклеточных и клетка-матрикс спаек (Цифры 4В и 4 C). Rb (в см 2 х Ом), является сопротивление межклеточных контактов в текущем потоке и тем самым обратной меры классической проницаемости. Высокое Rb означает низкую проницаемость по отношению к тока. Альфа (в см х Ом 0.5), является мерой вкладов импеданса, вытекающих из клеток-электродные переходы. Модель для количественной клетка-клетка и клетка-матрикс контактов был введен 1991 по Гиавер и Keese и основан на предположении, что клетки являются круглыми, в форме дисков, объекты, которые имеют изолирующую мембрану, курсор над электродом и заполнены электролитом проведение 2 .изолирующие свойства клеточной мембраны остается только три пути для тока: а) между вентральной поверхности клеток и электродом, б) между межклеточных контактов и С) через клетки (вероятно только когда используется высокая частота измерения ). Более подробный вывод и объяснение можно найти в работах Ло и др. 3,12. Micromotion Было показано, что небольшие колебания в сигнале сопротивления (фиг.4А) обусловлены тонкими, случайных движений клеток в слоях сливающихся клеток, а также клеток, движущихся на и от электрода в разреженных культур 2. Этот аспект данных временного курса ЕСНГ описываемых Ло и Opp др.. 13,14 часто упускается из виду и лучше всего видно при измерении с 1E массивов и в самой чувствительной частоты для учета пара-и внутриклеточных текущих-путей. Расчет этой ячейки вызвало шум (микроподвижность) не является частью гое стандартное программное обеспечение измерения, хотя в последней версии быстрое преобразование Фурье (БПФ) интегрируется. Запись данных RTC с частотой дискретизации 1 Гц в течение 1 часа при 4 кГц обеспечивает достаточное разрешение для расчета ЕС микродвижения. Этот расчет дает один единственный значение и могут быть непосредственно использованы для статистического анализа. Продлен обсуждение на использовании частотного анализа для микродвижения можно найти в другом месте 15. В качестве альтернативы БПФ другие стратегии анализа могут быть использованы, например, дисперсии приращений. Разница более чувствителен к небольшим изменениям в микродвижения, но из-за этой чувствительности сравнение отдельных экспериментов становится трудно. Склоны спектра мощности являются более надежными измерение микродвижения (рис. 4D). Здесь площадь под кривой можно рассматривать как сумму микродвижения или шума клетки создают. Следовательно, тем круче наклон спектра мощности, чем меньше площадь под кривойи чем меньше Micromotion. Электрический заживления ран анализ Для изучения миграцию клеток, как правило, механические раны наносятся царапины клетки от планшета для культуры с наконечниками, сотовые скребками или конкретных марок и следовать их реэмиграции микроскопически 16. Этот метод имеет очевидный недостаток, что размер нуля изменяется и, как правило, слишком большой, чтобы пренебречь влиянием пролиферации клеток на процесс заживления ран. Ранив функция ЕСНГ использует высокое напряжение, высокая частота импульсов, чтобы получить бесплатный электрод клеток и впоследствии следует реэмиграции из соседних клеток для замены смерти клетки (рис. 5, а). Преимущество этого способа автоматизированного сравнению со стандартными, трудоемких скретч анализов является то, что ЕСНГ производит хорошо воспроизводимый рану точным диаметром 250 мкм, который закрывает в течение нескольких часов, чтобы изучить чистый миграции. Кроме того, электрический импульс сделатьэс не удалить покрытие белка и секретируется внеклеточный матрикс. В предположении, что клетки remigrate на электроде со всех сторон, скорость миграции легко может быть вычислена делением радиуса раны на время, необходимое для закрытия раны 17. В качестве альтернативы электрической ранения, недавно так называемый метод электрический забор был введен (не показан). Импульсы Здесь высокие текущие предотвратить прикрепление и миграцию клеток на электродах после прививки. Клетки будут расти вокруг измерительного электрода и начинают мигрировать внутрь, как только электрические импульсы выключены. Преимущество электрическим забором над электрического ранения в том, что поверхность электрода не было изменено на рост клеток или удаления клеток, что является важным для измерения влияния различных покрытий на клеточной миграции. Стимуляция Сотовый В дополнение к изучению миграции клеток, импедансной спектроскопии идеально подходит дляоценки последствий лекарств и токсинов на клетки. 5В представляет классическую стимуляция / ингибирования эксперимент, где тромбина был использован, чтобы вызвать гипер-проницаемость в сливной ЕС барьера сжатия и зазора формирования клеток, что проявляется в виде транзиторной падению сопротивления . По предварительной инкубации с ингибитором киназы Rho Y-27632 большую часть ответа тромбина уменьшается за счет снижения базального натяжения клеток 18 и блокируя образование стресс волокна 19. Затем киназы Rho блокатор был использован в различные моменты времени после того тромбина, что приводит к немедленному и полного восстановления барьера ЕС. Здесь преимущество непрерывной системы измерения импеданса для изучения острых клеточные ответы становится очевидным. В регулярных конечных анализов (например, окрашивания иммунофлюоресценции или макромолекулы прохода), это острая реакция на используемой блокатора было бы очень трудно, если не невозможно обнаружить и количественно. Важно отметить, что с яИзмерения mpedance проницаемость по отношению к ионам описано и не к макромолекул. Пожалуйста, обратитесь к Аман и др.. 20, где отличный сравнение между измерениями ЕСНГ и макромолекулы прохода экспериментов предусмотрено. Рисунок 2. Представитель измерения. MVEC были выращены на желатиновой покрытием 8W1E массивов с низкой плотностью посева 5000 клеток / см 2 и записи MFT был выполнен в течение 10 дней. Измерение иллюстрирует различные чтения выходы эксперимента ЕСНГ: A) адгезии, распространения и нераспространения; Б) формирование и созревание сливной клеточный барьер, С) заживление ран после применения электрической раны; D) стимуляция с вазоактивных агент тромбина. Две стрелки указывают среду прохладительные напитки, которые были проведены с интервалом в 4 дня и дают представление о чувствительности измерений к механическим раздражителям и изменениям температуры и рН. Изображения в верхней панели соответствуют измерению и были приобретены непосредственно из измерительного электрода. Фазового контраста изображение слева показывает эндотелиальные клетки 24 часов после инокуляции, начиная покрыть электрод. В иммунофлюоресценции фотографий в центре и на правом настоящему F-актина окрашивания конфлюэнтного эндотелия слоя до и после стимуляции тромбина (1 ед / мл). Тромбин вызывает сокращение эндотелиальных клеток образованием так называемых стрессовых волокон и переходного отверстия между эндотелиальными зазоров (стрелки и изображение вставки), распознаваемых в сигнале ЕСНГ падением устойчивости к базовой линии. Здесь чувствительность измерений становится очевидным, и как изменения в клеточном слое коррелирует с сигналом импеданса.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. Прикрепление клеток и рост. MVEC от того же донора высевали с тремя различными плотностями на желатиновых покрытием 8W10E массивов и рост клеток был записан в нескольких частот для 60 часов.) Значения сопротивления для трех условий при их оптимальной частоте 4 кГц для измерения формирование барьера. Все три плотности посева установлено сливающийся барьер ок. 1200 Ω в конце измерения;. Ставки распространения однако (наклон кривых) заметно отличаются Б) Измерение емкости при 64 кГц дает представление о адгезии и распространения. Адгезия является вitial фаза плато на кривой емкости (между 2-8 ч). Распространение, который находится в линейной зависимости от покрытия электрода, представлена ​​наклона кривой и завершается после 10-30 ч в зависимости от плотности посева. Момент времени т 1/2 (половина максимальная охват) могут быть использованы для статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4. Характеристика сливной барьера. Два MVEC доноров с различным числом проходов (проход 3 и 6) высевали на покрытые желатином массивов 8W1E и измерение MFT проводили в течение 30 ч, чтобы характеризовать барьер EC.) Сопротивление Измерения показывают, что чем моложе донор 1 имеет более высокое сопротивление ок. 11000 Ω в сравнении с ок. 7500 Ω старшего донора 2. Н.э.) возможности моделирования ЕСНГ были использованы, чтобы найти причину для снижения сопротивления. Моделирование показало, сравнимую Rb взаимодействие клетка-клетка и указанный ослабленный взаимодействие клетка-матрица альфа качестве возможной причины. D) RTC была выполнена количественно Micromotion в сливной клеток слоя преобразования Фурье, где площадь под кривой пропорциональна микродвижения . Анализ спектров показывает меньшую Micromotion старшего донора 2 и тем самым поддержать то, что уже можно считать из сигнала сопротивления (меньше дисперсия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 5 "FO: контент-ширины =" 5 дюймов "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/> Рисунок 5. Миграция клеток после ранения и электрического воздействия тромбина стимуляции. Импеданс записи проводили при 4 кГц с максимальным временным разрешением.) MVEC донор 1 был использован в канале 3 и донором 2 в канал 6 на желатиновых покрытием массивов 8W1E и выращивали до слияния. Затем электрический рана была создана путем применения двух импульсов 5 В при 60 кГц с длительностью 20 сек каждый. Младший донор 1 показал лучшее заживление ран возможности, основанные на быстрее закрытия раны (миграция, наклона кривых) и более высокое сопротивление после ранения в сравнении с более старой донора 2. B) HUVEC выращивали на желатиновых покрытием массивов 8W10E. При слиянии клеток были сыворотка голодали в течение 1,5 часа при замене полной культуральной среде с базальной среде плюс 1% сывороточного альбумина человека (HSA). Намвозраст простой среде с HSA является важным шагом, так как компоненты сыворотки блокировать реакцию тромбина. Как только стабильное сопротивление плато было обнаружено, тромбин был добавлен непосредственно в лунки и тщательно перемешивают с 200 мкл пипетки. Максимальный эффект тромбина видна через 30 мин, отличающийся тем, переходного падение устойчивости к базовой линии и ок. На 30-50% ниже сопротивление после восстановления. Клетки либо преинкубировали с Rho-киназы блокатора Y-27632 в течение 30 мин или блокатора был добавлен 20, 30, или 40 мин после тромбина того, что сразу уменьшилась тромбина эффект. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры .