Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Robert Szulcek; Harm Jan Bogaard; Geerten P. van Nieuw Amerongen

doi:10.3791/51300

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Bioengineering

Elétrica Cell-substrato impedância Sensing para a quantificação do endotelial Proliferação, Barreira Function, e Motilidade

Published: March 28, 2014

doi:

10.3791/51300

Robert Szulcek¹, Harm Jan Bogaard¹, Geerten P. van Nieuw Amerongen²

¹Department of Pulmonary Diseases,Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center, ²Department of Physiology,Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center

Summary

Este protocolo avaliados eléctrico Cell-substrato impedância de detecção, um método para gravar e analisar o espectro de impedância de células aderentes, para a quantificação da ligação da célula, a proliferação, a motilidade, e as respostas celulares a estímulos farmacológicos e tóxicos. Detecção de permeabilidade endotelial e avaliação de célula-célula e célula-substrato contatos são enfatizadas.

Abstract

Eléctrica Cell-substrato impedância de detecção (ECIS) é um sistema de medição de impedância in vitro para quantificar o comportamento de células numa camada de células aderentes. Para este fim, as células são cultivadas em câmaras de cultura especiais no topo da opostas, eléctrodos de ouro circulares. Uma pequena corrente alternada constante é aplicado entre os eléctrodos e o potencial é medido através. As propriedades de isolamento da membrana celular criar uma resistência contra o fluxo de corrente eléctrica, resultante num aumento do potencial eléctrico entre os eléctrodos. Medição da impedância celular desta forma permite o estudo automatizado de fixação das células, crescimento, morfologia, função e mobilidade. Embora a própria medição ECIS é simples e fácil de aprender, a teoria subjacente é complexa e seleção das configurações corretas e análise e interpretação dos dados correto não é auto-evidente. No entanto, um protocolo clara descrevendo as etapas individuais do experimentaldesign para preparação, realização e análise da experiência não está disponível. Neste artigo, o princípio básico de medição, bem como as possíveis aplicações, são discutidas as considerações experimentais, vantagens e limitações do sistema ECIS. A guia é fornecido para o estudo da ligação de células, espalhando e proliferação; quantificação do comportamento das células em uma camada confluente, no que diz respeito à função de barreira, a motilidade celular, a qualidade de célula-célula e célula-substrato aderências e quantificação de cicatrização de feridas e respostas celulares a estímulos vasoativas. Os resultados representativos são discutidos com base microvascular humana (MVEC) e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), mas é aplicável a todas as células que crescem aderentes.

Introduction

ΩΩΩHere apresentamos Elétrica Cell-substrato impedância Sensing, conhecido como ECIS, um método específico para medir e analisar o espectro de impedância de células aderentes em cultura ^1. O objectivo deste protocolo é oferecer um guia de aplicação geral para o uso deste tipo particular de impedância baseado ensaios celulares e fornecer protocolos para algumas das principais funções do número sempre crescente de aplicações. O foco será sobre o estudo da proliferação celular, a função de barreira, junções celulares, e motilidade celular.

Desde ECIS e seu modelo associado para transformar os dados de espectroscopia de impedância em parâmetros biologicamente relevantes foi introduzida em sua forma atual para a comunidade científica por Giaever e Keese em 1991 ^2, que tem sido muitas vezes referido como um sistema de medição de TEER (trans -epitelial resistência elétrica), que não é preciso. As diferenças parecem marginal no início, massão importantes para a interpretação de dados. Para medições Teer clássicos, as células são cultivadas em filtros permeáveis para caracterizar mecanismos de transporte paracelular, que são dominadas por junções apertadas epiteliais ou endoteliais junções aderentes ^3. Geralmente, dois eléctrodos posicionados acima e abaixo do filtro são usados para aplicar uma corrente directa (DC) de fluxo sobre a camada de células e outros dois eléctrodos para medir a queda de tensão resultante ^4. A resistência eléctrica é calculado usando a lei de Ohm, o que permite uma descrição numérica da qualidade da barreira celular.

ECIS segue esse princípio básico e estende-lo. No sistema ECIS, as células são cultivadas em opostos, eletrodos de ouro circulares que são incorporados no fundo de pratos especiais de cultura celular. O número de eléctrodos por cavidade de cultura é variável, dependendo da aplicação e os eléctrodos têm um diâmetro padrão de 250 mM e, em alguns casos, um contra-eléctrodo maioré utilizado para completar o circuito. ECIS usa uma corrente alternada constante (AC) de 1 mA com uma dada frequência, em vez de uma corrente contínua. A impedância é calculado a partir das mudanças correspondentes na tensão (em mV) entre os eletrodos. ECIS oferece a possibilidade de medir a impedância sobre uma gama de frequências para estudar as propriedades de frequência celulares dependentes, que tem diversas vantagens sobre TEER e serão explicadas em detalhe neste artigo. Em primeiro lugar, a medição de impedância complexa permite separar a impedância total em resistência da barreira de células e células de capacitância. Além disso, tendo em dados em múltiplas frequências e aplicando um modelo matemático, pode-se diferenciar entre a impedância da junção (hermeticidade dos contactos célula-célula) e impedância causado pelas interacções célula-substrato (a distância da membrana basal de células a matriz subjacente), bem como a contribuição da capacitância da membrana celular. Em segundo lugar, a proliferação celular e a motilidade pode ser apreciado, uma vez que a células estão em contato direto com os eletrodos. Em terceiro lugar, o substrato e os eléctrodos são suficientemente finas para permitir que o campo brilhante e de microscopia de contraste de fase.

Base em medições Impedância: A impedância complexa

A base para a medição da impedância eléctrica de objectos biológicos (por exemplo, células) é a lei de Ohm, um princípio de electro-técnico básico, que descreve a relação entre a resistência (R), a corrente (I) e tensão (U) de um circuito eléctrico num determinado tempo (t).
Aplicável em circuito DC: R (t) = U (t) / I (t)

Ao trabalhar no sistema de corrente alternada, corrente e tensão não só diferem na sua amplitude, mas também na sua fase (φ). Agora, a resistência já não é suficiente para descrever essas relações. Em vez disso, a impedância complexa (Z) ou, na maioria dos casos, a magnitude da impedância (| Z |) são utilizados, contendo a resistência anteriormente descrito óhmico mais reatância (X), que resultados do AC fluir através capacitores e indutores de condução da mudança de fase entre tensão e corrente ^5.
Aplicável em circuito AC: | Z (f) | = √ (R ² + X (f) ²⁾
φ = arctan (X / R)

Para as medições de impedância em células intactas, devido às características da sua membrana, as células actuam como uma ligação paralela de resistência e condensador. Aqui, a resistência representa a oposição ao fluxo de corrente, enquanto que a capacitância (C) descreve a separação dos transportadores eléctricos no isolamento de bi-camada da membrana da célula que provoca a polarização da célula. Deste modo, X é dominado pelas propriedades capacitivas da membrana celular.
X (f) ≈ (2 * pi * f * C _celular) ^-1

Como X é dependente da frequência, a variação da frequência de medição permite estudo de diferentes propriedades estruturais e funcionais da célula. O dispositivo mede ECIS ambos R e X, permitindo o cálculode | Z |, C e φ.

Quantificar camadas de células inteiras com espectroscopia de impedância: O circuito elétrico equivalente.

Como anteriormente explicado, quando uma célula é colocada em um campo eléctrico, que mostra as propriedades de componentes electrónicos passivos. Se agora, em vez de uma única célula, uma camada de células cultivadas todo em cima de eléctrodos e suplementado com meio de cultura de células é analisada, o modelo simples da resistência e do condensador deve ser estendida a toda uma rede eléctrica. Neste chamado circuito equivalente, a resistência do meio de cultura (R _Med.), bem como de capacitância (C _Electr) e da resistência (R _Electr) caracterizar a interacção eléctrodo / electrólito devem ser considerados ^3,6.

Um exemplo simplificado, em geral de um tal circuito equivalente de uma camada de células aderentes em crescimento pode ser encontrada na Figura 1. A vantagem de uma tal matemáticostratégia para descrever um sistema biológico é que esses circuitos podem ser refinados ad libitum e ajustado às questões experimentais específicos, por exemplo, considerando impedância causada por organelos intra-celulares ou para distinguir as influências de célula-célula (R _junção) e adesões célula-substrato _(Sub R) em ^7,8 impedância global. No entanto, o objetivo para a modelagem deve ser sempre usar o menor número de elementos que descrevem todas as características do espectro de impedância medida para permitir correlações significativas.

Figura 1. Esquema do sistema de ECIS e circuito equivalente representativo para uma camada de células que crescem aderentes. A) Secção transversal de uma cultura ECIS bem. As células estão a crescer em cima de detecção e contra-eléctrodo e umre coberto com meio de cultura. Os eléctrodos são ligados a um amplificador lock-in e de um sinal de CA é aplicada através de uma resistência de 1 M para criar uma fonte de corrente constante. Os estímulos podem ser adicionados diretamente ao meio de cultura, em qualquer ponto no tempo. B) medidas ECIS a soma de todas as contribuições individuais para a impedância. A resistência do meio de cultura (R _Med.), bem como a impedância causada pela interface eléctrodo / electrólito, que é a simplicidade apresentado como uma combinação paralela de um resistor (R _Electr) e um condensador (C _Electr), e também as propriedades eléctricas da membrana celular, descrito por uma ligação em paralelo da resistência (R _celular) e de capacitância (C _Mem), todas têm de ser considerados. R _celular é variável, uma vez que está dependente da permeabilidade da célula no sentido da corrente. O circuito equivalente pode ser estendido e refinado ad libitum. Como um exemplo de junção (R _Junc) quantobem como resistência subendotelial (R _Sub) foram adicionados ao circuito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetros de impedância e seu significado biológico

Os dois parâmetros mais diretos derivados de medidas de impedância são a resistência ea capacidade de células. Resistência representa qualidade e função da barreira de células e, portanto, leva em consideração a resistência a para-e fluxo de corrente trans-celular. Capacidade fornece uma medida geral da cobertura do eletrodo. A característica distintiva da ECIS é que, com a ajuda de circuitos equivalentes e modelar os parâmetros globais de fornecer insights sobre muitas propriedades mais celulares, incluindo a célula-célula e célula-substrato aderências, que serão discutidos mais adiante neste artigo.

Antes de começar: conside Experimentalrações

Instalação de medição – A instalação consiste em vários componentes separados: dispositivo ECIS com a eletrônica de medição; PC para aquisição de dados; titular matriz para a 8 – ou sistema de 96 poços; matrizes ECIS e da cultura de células de escolha. O titular da matriz deve ser colocada numa incubadora e ligado ao dispositivo ECIS fora da incubadora. O computador deve estar equipado com o software ECIS (1.2.123.0 14 de fevereiro de 2013) e ligado ao dispositivo de ICE.

Seleção Array – Há uma variedade continuamente crescente de matrizes ECIS, projetado para múltiplas aplicações. As matrizes convencionais são a 8W1E e as matrizes 8W10E, que são compostas por oito poços de cultura (indicado por W) compreendendo um ou dois eléctrodos de medição 10 (indicado por E), respectivamente. Um eléctrodo contador completa o circuito grande, mas a sua impedância é essencialmente insignificante na medição real ^6. O titular conjunto de 8 poços padrão pode hospedar dois porrrays, resultando num total de 16 poços de cultura. Os eletrodos de ouro são 50 nm de espessura, delineado com uma película isolante e montado em qualquer um substrato de policarbonato Lexan opticamente clara ou uma placa de circuito impresso (PCB). As matrizes de PCB são mais robustos e rentável. Os slides transparentes permitem a microscopia óptica e de imunofluorescência. O que deve ser considerado é que a matriz 1E aumenta flutuações no sinal de resistência causada por movimentos de células e é necessário para os estudos de cicatrização de feridas. Além disso, os eletrodos individuais permitem correlação de sinais elétricos e ópticos. Nos conjuntos de eléctrodos múltiplos, o sinal é em média ao longo de vários eléctrodos, o que, devido ao aumento da área de medição inclui mais células na medição, limita a polarização dos dados por meio de inoculação desigual e o crescimento das células e reduz a desfocagem do sinal devido à célula movimentos. Portanto, os conjuntos de eléctrodos múltiplos são úteis para estudar a proliferação celular e a formação da barreira. Próximo depadrão matrizes há matrizes especiais disponíveis para a aplicação da tensão de cisalhamento ^9, para estudar a quimiotaxia ^10, migração celular e proliferação, bem como placas de 96 poços para exames de alto rendimento. Para concluir, a matriz a ser utilizado é fortemente dependente da questão científica e tipo de célula e devem ser selecionados e testados cuidadosamente.

Freqüência de medição – A modelagem do Rb e alfa (ver análise de dados) requer medições de freqüência múltiplas (MFT). Caso contrário, a impedância pode ser medida ao longo do tempo em uma freqüência específica tipo de célula (SFT), com a vantagem de que os dados podem ser coletados com uma resolução temporal maior. A frequência de medição mais sensível para um tipo específico de célula pode ser encontrada através de exames de frequência. Ao traçar impedância respectivamente resistência versus freqüência em um gráfico log-log a freqüência em que a diferença entre livre de células e eletrodo revestido de células é maior é a freqüência em que as células bloquear tele atual mais eficaz. No caso de células endoteliais (CE) esta freqüência é de cerca de 4 kHz.

Densidade de semeadura – Como em toda densidade à base de células experimento de semeadura normal depende do problema científico. Ao estudar a adesão e propagação ou formação de uma barreira, células endoteliais deve ser semeada com uma alta densidade de 40,000-60,000 células / cm ² para garantir uma confluentes, barreira estável depois de 48 horas. Se o foco da experiência é a proliferação, as células endoteliais deve ser semeada com uma baixa densidade de cerca de 2,000-10,000 células / cm ^2.

Protocol

1. Preparação do Sistema de Medição Pré-aquecer o suporte da matriz, numa incubadora a 37 ° C antes de começar a experiência para evitar a condensação. Encha caixão água da incubadora com água destilada, para evitar a secagem dos poços. Executar todas as manipulações de células e matrizes numa câmara de fluxo laminar, em condições estéreis. 2. Preparação de Arrays e inoculação de células NOTA: As matrizes ECIS precisam ser limpos e estabilizada antes de uma experiência para evitar deriva eléctrodo, para melhorar a reprodutibilidade bem-a-poço e a relação sinal-para-ruído. Portanto duas opções estão disponíveis: A) pré-tratamento dos eletrodos com L-cisteína e B) a função de estabilização da ECIS. Opção A: L-cisteína é recomendado como o pré-tratamento mais consistente, mas pode, em alguns casos especiais interagir com coatin proteínags sobre os eletrodos. Os volumes apresentados são utilizados para matrizes de 8 poços padrão. Adicionar 200 ul / cavidade de 10 mM de L-cisteína. Cisteína limpa e modifica a superfície do eletrodo fornecendo uma capacidade elevada e reprodutível eletrodo. Incubar 15 min a temperatura ambiente (RT). Lavar duas vezes 500 ul / poço com água ultra-pura (tipo 1). Não utilizar tampões de fosfato, o que pode interferir com a adsorção de algumas proteínas. Além disso, evite soluções contendo soro antes do revestimento, uma vez que a superfície de ouro irá absorver as primeiras macromoléculas trazidas em contato. Brasão com 200 ul / poço quente 1% de gelatina. Incubar 30 min a 37 ° C. Retire a gelatina, mas não deixe que a superfície seca. Isso pode danificar os eletrodos. Lave uma vez com água ultra-pura (tipo 1). Adicionar 400 ul / poço de meio de cultura de célula completa (contendo soro, antibióticos e todos os factores de crescimento). Deslize matriz em conjunto um titulard ter certeza de que a matriz é posicionada de tal forma que os nove de ouro almofadas quadradas são devidamente contactado pelos pinos pogo com mola e parafuso de ajuste de correção mão apertada. Tenha cuidado com matrizes transparentes, a camada de ouro podem ser facilmente danificados. Abra o software de medição e pressione Configuração seguido por cheque na seção "Coleta de Dados" para realizar uma medição da impedância rápida de cada bem individual. Os valores resultantes são a linha de base de medição e serão automaticamente armazenados nos "Comentários". A verificação também irá determinar automaticamente o tipo de matrizes ECIS usado. Verifique as matrizes selecionadas na seção "Bem configuração". O diagrama disposição acende uma luz verde para poços conectados corretamente e vermelho para poços conectados vazios ou incorretas. Ainda assim, sempre se certificar de que as matrizes foram colocados corretamente no suporte. NOTA: Se a limpeza e revestimento foram bem-sucedidas as matrizes 8W1E ECIS tem acapacitance de cerca de 5 nF e as matrizes 8W10E de 50 nF, o que resulta numa resistência de linha de base de cerca de 2.000 e 200 Ω, respectivamente. Remover matriz de suporte. Células de sementes como uma suspensão de células individuais em 400 uL / poço de meio de cultura celular completo. Opção B: A função de estabilização da ECIS pode ser usada como uma alternativa ou em combinação com o tratamento com L-cisteína e se ocorrer problemas com desvio de eléctrodo ou de grandes diferenças em resistência ao bem-a-poço e capacitância. Realizar o tratamento de cisteína (opcional) e eléctrodos prï ¿½ revestimento com proteína (opcional). Adicionar 200 ul / poço de meio completo a cada poço e colocar a matriz no suporte da matriz. Software de medição Abrir e pressione Configuração seguido de Verificação para determinar a matriz está conectado corretamente e medir Z inicial, R e C. Estabilizar os eletrodos pressionando <strong> Estabilizar na seção "Coleta de Dados". A ECIS irá aplicar uma corrente elevada (ca. 3 mA), alta freqüência (64 kHz) pulso para limpar os eletrodos. Verifique eletrodos novamente. Capacitância deve ser aumentada e os valores de resistência deve estar em uma faixa comparável. Se os valores de capacitância e resistência ainda não são satisfatórios, repetir a estabilização. Remover conjunto do suporte e inocular células. 3. Criação de Medição de Software e Aquisição de Dados Colocar a matriz no suporte da matriz, tal como descrito antes. Software de medição Abrir e pressione o botão de configuração na seção "Coleta de Dados" para conectar o software ECIS ao instrumento ECIS e executar outro poço Confira. Verifique as matrizes selecionadas na seção "Bem configuração". Selecione os poços a serem medidos no "Bem CONFIGURAÇÃOsecção ião ". Selecione o modo de medição do "coletar dados" opções: Por uma série de tempo em uma freqüência fixa, selecione Freq Único. / Hora (SFT) e escolher a frequência de medição do menu drop-down. Para a medição da cobertura de eletrodo e modelagem de Rb e Alpha, selecione Freq Múltipla. / Hora (MFT). O dispositivo ECIS medirá automaticamente em todas as freqüências disponíveis. Para micromovimento (ver análise de dados) selecionar Rápido Tempo Colete (RTC) e ajustar a frequência de medição e frequência de amostragem. Aqui, a resolução temporal padrão é uma amostra por segundo (1 Hz), frequência de amostragem, mas também pode ser aumentada para acompanhar as mudanças rápidas na impedância até 25 Hz (para o Z-teta). Nota importante: no modo RTC apenas um único bem é medido. NOTA: Se micromovimento precisa ser medida em vários poços, posteriormente, vá para Ajuda> Mostrar barra de ferramentas itens perito / Menu> Acqùire> Multi-Bem RTC. Especifique o limite de tempo (h) na seção Coletar Dados, o ECIS vai agora medir os poços selecionados em ordem numérica. Depois de iniciar a medição, o software irá pedir para especificar o número de ciclos. Digite o valor para a freqüência com que a medida precisa ser repetido. Para SFT e MFT, selecione o intervalo de tempo (segundos) entre as medidas ou se os dados precisam ser adquiridas o mais rápido possível deixar esta opção desmarcada. NOTA: Para obter os dados do dispositivo ECIS utiliza um multiplexador para mudar de um bem para outro, com uma taxa de aquisição mínimo SFT de 0,25 seg e 7,5 seg para MFT. Ou seja, o intervalo é dependente do número de poços e freqüências selecionadas. Para as medições sobre as células em proliferação lenta ou uma simples gravação de resistência em função do tempo, usa intervalos de 600 segundos ou mais. Press Start, nomeie o arquivo e selecionar o local para armazenar os dados. NOTA: O tamanho do arquivo não deve ser um problema, desde que os dados ECIS são salvos em um tipo de formato de texto simples chamado *. abp, que nunca excede várias centenas de MB, mesmo com todas as freqüências de medição e número de poços selecionados. Pare de correr pressionando Concluir. 4. Alterar Médio e Manipulação celular Imprensa Pause, isto irá parar a aquisição de dados, mas continuar a executar o relógio experimental. Retire o conjunto do suporte e manipulá-lo sob uma bancada de fluxo laminar (ou seja, meio mudança). Coloque variedade de volta no suporte e nem clique em Verificar conexão ou Retomar Experiment continuar aquisição de dados. O software de medição vai colocar uma marca de tempo no conjunto de dados. 5. Estimulação aguda Durante Aquisição de Dados NOTA: A segunda opção é para manipular as células durante a aquisição de dados para acompanhar as mudanças imediatas. Isso só é possível; Quando as amostras não precisa de ser esterilizada no ulterior decurso da experiência. Adicione o estímulo diretamente para o bem e certifique-se de misturar cuidado com um mL pipeta 200. Apontar Mark tempo manualmente, pressionando Mark e adicionar um comentário. 6. Ferimento Elétrica NOTA: encontrar as configurações corretas para o tipo de célula utilizada é a chave para ferimentos elétrica. Se o ferimento é muito curto isto pode resultar na remoção insuficiente de células, ao passo que se o ferimento é muito longo e / ou áspera que pode danificar os eléctrodos (especialmente sobre as matrizes transparentes). Portanto, vários pulsos curtos ferindo são recomendados. Para culturas HUVEC dois 10-20 seg pulsos longo ferimento de 5 V a 60 kHz cada foram encontrados ideal usando a ECIS 1600R. Em geral, recomenda-se a utilização de altas frequências> 20 kHz para manter elevados campos uniformes entre as células e para evitar qualquer dano para os eléctrodos. Realize ferindo during uma medição ECIS ativa. Ativar Wound / Setup electroporate, em seguida, clique Ferida e preencher o tempo (seg), a tensão da ferida (V para 1600 R) ou corrente (mA para Z e Z-Theta) e freqüência (Hz). Os valores padrão indicadas são baseadas no tipo de matriz e dispositivo de ICE. Selecione os poços ferida na seção "Bem configuração". Apenas os poços marcados serão feridos. Ativar Atraso Até Hour e preencher o tempo de espera para ativar a função de atraso ferida. Esta função pode ser interrompida a qualquer momento pressionando Parar ou a aplicação de uma ferida manualmente. Apenas um comando atraso pode estar ativo de cada vez. Pressione Ativar e clique em OK na janela pop-up para iniciar ferindo. Certifique-se de que o sinal de resistência cai para a impedância compensada após ferimento, caso contrário, repetir o ferimento. 7. Análise de Dados </p> Representação de dados e exportação. Medição Finish ou carregar dados definido através File -> Open. Selecione poços a serem exibidos a partir da janela "Configuração Bem". Poços individuais grupo para apresentar a média. Escolha parâmetro a ser exibido na barra de ferramentas superior (Z, R ou C). Selecione o tipo de gráfico na barra de ferramentas superior (T = tempo, F = freqüência, 3D = cachoeira blot). Definir compensar gráfico e variedade com os controles deslizantes abaixo da janela de gráfico ou preencha os valores exatos nos controles adjacentes. Escolha entre os básicos "Opções Time-Series" na seção "Analisar" para realizar o desvio padrão, rodando média ou normalização dos dados. Ative Especialista Barra de Ferramentas no menu Ajuda para operações mais avançadas, como Nyuist enredo e transformação de Fourier. Utilize "Opções de visualização" na seção "Analisar" para definir range de x-e y-eixos e exportação gráfico. Exportação de dados selecionado para um arquivo do Excel através de Arquivo -> Exportar Dados -> Para Excel (seleccionado) e usar um software de terceiros de escolha para análise em profundidade, estatísticas e representação conforme necessário. Modelagem de Rb e Alpha. NOTA: Para a modelagem, recomenda-se usar um livre de células, o meio preenchido bem como referência. Medição Finish MFT ou carga MFT conjunto de dados. Se um bem de referência livre de células é pressionar disponível tanto em Localizar para selecionar automaticamente o valor de referência ou Definir para selecionar o ponto de tempo livre célula manualmente "Freq. Modelagem Scan" na seção "Análise". Se não há qualquer referência isento de células, importar um valor de referência a partir de um outro conjunto de dados. Abra o conjunto de dados de referência (certifique-se que foi utilizada a mesma matriz e média) e usar Localizar ou Definir para selecionar o valor de referência.Em seguida, navegue para os dados medidos e imprensa Get. Se não houver dados de referência livre de células definidas disponível, utilizar o padrão de fábrica. Imprensa Modelo para iniciar os cálculos. Modelando pode demorar vários minutos, dependente do tamanho do conjunto de dados. Cálculo dos micromovimentos. NOTA: Este cálculo não é parte do software de medição, mas pode ser realizado com qualquer software de processamento de sinal. Termine medição RTC ou carregar conjunto de dados RTC. Normalizar estabelecidos pela resistência média de todo o período de dados. Quebre definidos em segmentos com um comprimento de 256 pontos de dados dados e limpar cada segmento por uma janela Hanning. Execute uma transformação Fourier 256 pontos e média resultando espectros de freqüência para um único lado do espectro de potência 129 pontos para minimizar o ruído aleatório e aumentou o sinal biológico. Freqüência complô contra amplitude em um gráfico log-log e aplicarajuste linear de mínimos quadrados. A inclinação do ajuste linear é uma medida do ruído no sinal global e, assim, micromovimento das células.

Representative Results

Criação de um experimento é bastante simples eo próprio medição é totalmente automático, mas como é frequentemente o caso, análise e interpretação dos dados corretos são cruciais. Na seção de dados representativos de um guia é fornecido para a interpretação dos parâmetros mais importantes fornecidos por espectroscopia de impedância com ECIS. Isso será útil para decidir por qual tipo de problema científico uma medição ECIS pode ser útil e quais os parâmetros que devem ser registrados. Um experimental leitura fora típico pode ser geralmente dividido em uma fase de crescimento após a inoculação das células e uma fase de patamar quando as células atingem a confluência. Cada uma destas fases fornece informações sobre diferentes propriedades celulares. Uma medição representativo é mostrado na Figura 2 e dividido em quatro subfases para analisar a) a adesão celular, proliferação e propagação, B) formação de uma barreira CE maturação; C) a migração de células, após a geração de um elétricoai ferida, e D) a resposta celular ao estímulo com o agente vasoactivo trombina. De contraste de fase e imunofluorescência imagens foram obtidas diretamente do eletrodo de medição durante as diferentes subfases para ilustrar a ligação entre a cobertura do eletrodo, o estado celular, e sinal de impedância gravado. A adesão, divulgação e proliferação Cada tipo de célula tem a sua adesão e crescimento curva característica que pode ser manipulada pela variação da densidade de semeadura, revestimento com proteínas da matriz extracelular ou outros estímulos. Uma das principais dificuldades para estudar esses processos é diferenciar entre a adesão, divulgação e proliferação. Wegener et al. 11 deram uma descrição detalhada para a utilização de uma combinação de resistência e capacitância para distinguir entre estes parâmetros e na figura 3, torna-se óbvio que a resistência e capacitância podem complementar-se. É importante parao estudo da adesão e propagação de compreender a influência da frequência de medida, porque aqui o campo eléctrico provoca uma polarização da membrana celular das células em suspensão de 8, o que obriga a que a corrente flua exclusivamente em torno das células. Quando as células anexar eles começam a restringir o fluxo de corrente, espalhando ao longo dos eletrodos e capacitância diminui de forma linear com a porcentagem de área aberta no eletrodo (área fracionária). Por isso, a adesão, divulgação e proliferação pode ser quantificado melhor, durante a gravação de capacitância em uma freqüência superior a 40 kHz (Figura 3B), onde a diminuição da capacitância é direta, proporcionalmente à cobertura do eletrodo. Alternativamente, a resistência à sua frequência de medição mais sensível é uma medida directa para a diferenciação e maturação de células em uma barreira confluente (Figura 3A). Em adição à área fraccionada, Wegener et al. Introduzidos dois outrosparâmetros para quantificar a adesão e a cobertura de eléctrodo: t 1/2 (metade do valor máximo da capacitância), o qual é o tempo até que 50% do que o eléctrodo é coberto com células (Figura 3B, inserção), e o declive da curva de capacitância (s, não mostrado) como sendo a taxa de propagação e proliferação celular. A resistência como uma medida de qualidade de barreira Resistência é a parte da impedância que descreve melhor qualidade e função de barreira, porque negligencia componentes capacitivos de membrana, eletrodo e médio. Aqui a qualidade barreira prazo e não permeabilidade é utilizado, uma vez que a permeabilidade é, por definição, só depende de contatos célula-célula. Resistência no entanto é determinada pela capacidade das células e das suas interacções célula-célula e célula-matriz para bloquear o fluxo de corrente. Deste modo os diferentes tipos de células (clones e passagens) têm os seus valores de resistência específicas (Figura 4A). Embora a resistência dá um muito clearer idéia sobre a barreira celular, o sinal de impedância deve ser sempre levada em consideração. Modelagem de Rb e Alpha O software ECIS abriga uma característica particular, a capacidade de modelar dois parâmetros, que distinguem entre célula-célula e célula-matriz aderências (Figuras 4B e 4 C). Rb (em cm x 2 ohm), é a resistividade de contactos célula-célula para o fluxo de corrente e, assim, uma medida inversa de permeabilidade clássica. Alta Rb implica baixa permeabilidade para o fluxo de corrente. Alfa (em cm x 0,5 ohms), é uma medida para as contribuições de impedância decorrentes das junções de células-eléctrodos. O modelo para quantificar célula-célula e célula-matriz contactos foi introduzida 1991 por Giaever e Keese e baseia-se no pressuposto de que as células são circulares, em forma de disco objectos que têm uma membrana de isolamento, pairar sobre o eléctrodo e são preenchidos com a realização de electrólito 2 . Opropriedade de isolamento da membrana celular deixa apenas três vias para a corrente: a) entre a superfície ventral das células e eléctrodo, b) entre os contactos célula-célula, e c) através das células (apenas provável quando uma frequência elevada de medição é usado ). A derivação mais detalhada explicação e podem ser encontradas nos documentos de Lo et al 3,12. Micromotion Tem sido demonstrado que as pequenas flutuações no sinal de resistência (Figura 4A) são devidos a pequenos movimentos aleatórios, em células de camadas de células confluentes, bem como células que se deslocam dentro e fora do eléctrodo em culturas esparsas 2. Este aspecto de dados do curso em tempo ECIS descritos por Lo e Opp et al. 13,14 é muitas vezes esquecido e melhor visto na medição com as 1E matrizes e na freqüência mais sensível para explicar subcelulares atuais caminhos-para-e. O cálculo deste celular causada ruído (micromovimento) não faz parte do diae software de medição padrão, embora na versão mais recente de Transformação Rápida de Fourier (FFT) é integrado. Gravação de dados RTC com uma frequência de amostragem de 1 Hz para 1 hora a 4 kHz oferece resolução suficiente para o cálculo do micromovimento CE. Este cálculo fornece um valor único e pode ser usado diretamente para análise estatística. Uma discussão alargada sobre o uso de análise de frequência para micromovimento pode ser encontrada em outro lugar 15. Alternativamente, a FFT outras estratégias de análise pode ser utilizado, como variância dos incrementos. A variação é mais sensível em relação a pequenas mudanças na micromovimento, mas devido a esta sensibilidade a comparação das experiências individuais torna-se difícil. As encostas do espectro de energia são uma medida mais robusta de micromovimento (Figura 4D). Aqui, a área sob a curva pode ser visto como a quantidade de ruído ou micromovimento as células criar. Assim, o maior a inclinação do espectro de potência menor será a área sob a curvae quanto menor for o micromovimentos. Ensaio cicatrização elétrica Para estudar a migração de células, geralmente feridas mecânicas são aplicadas riscando as células fora da placa de cultura com ponteiras, raspadores de células ou selos específicos e siga sua remigração microscopicamente 16. Este método tem a desvantagem óbvia de que o tamanho do zero varia e é geralmente muito grande a negligenciar a influência da proliferação de células no processo de cicatrização da ferida. A função ferindo da ECIS utiliza uma alta voltagem, de pulso de alta frequência para obter um eléctrodo sem células e, subsequentemente, segue remigração de células vizinhas para substituir as células da morte (Figura 5A). Uma vantagem deste método automatizado, ao longo do padrão de trabalho intensivo ensaios raspadinha é que o ECIS produz uma ferida altamente reprodutível com um diâmetro preciso de 250 um, que encerra dentro de algumas horas, para estudar a migração puro. Além disso, o pulso elétrico fazeres não remover camada de proteína e matriz extracelular secretada. Sob a hipótese de que as células migre novamente no eletrodo de todos os lados, a taxa de migração pode ser facilmente calculado dividindo-se o raio de feridas pelo tempo necessário para o fechamento da ferida 17. Como uma alternativa para o ferimento eléctrica, recentemente, o assim chamado método de vedação eléctrica foi introduzido (não mostrado). Aqui altos pulsos de corrente impedir a fixação e migração das células sobre os eletrodos após a inoculação. As células vão crescer em torno do eléctrodo de medição e começar a migrar para o interior logo que os impulsos eléctricos são desligados. A vantagem de a vedação eléctrica sobre o ferimento eléctrica é que a superfície do eléctrodo que não foi alterado por um crescimento celular ou a remoção de células, o que é importante para medir a influências de revestimentos diferentes sobre a migração das células. Estimulação celular Em adição ao estudo de migração celular, espectroscopia de impedância é perfeitamente adequado paramedir os efeitos de drogas e toxinas sobre as células. Figura 5B apresenta um ensaio de estimulação / inibição clássico, em que a trombina foi usada para induzir hiper-permeabilidade da barreira CE confluentes por contracção e formação de diferença de células, que se manifesta como uma queda transiente no resistência . De pré-incubação com o inibidor da Rho cinase Y-27632 a maior parte da resposta a trombina é diminuída por redução da tensão da célula basal 18, impedindo a formação de fibras de stress 19. Em seguida, o bloqueador de Rho-quinase foi utilizada em diferentes pontos de tempo após a adição de trombina, levando a uma recuperação completa e imediata da barreira CE. Aqui, a vantagem de um sistema de medição contínua da impedância para estudar as respostas celulares agudas torna-se óbvia. Em ensaios de ponto final regulares (por exemplo, de coloração de imunofluorescência ou passagem macromolécula), esta resposta aguda ao bloqueador usada seria muito difícil, se não impossível, para detectar e quantificar. Importante notar é que, com impedance medições da permeabilidade a íons é descrito e não no sentido de macromoléculas. Por favor, referir-se a 20 Aman et al., Onde uma excelente comparação entre as medições ICE e experiências de passagem macromolécula é fornecido. Figura 2. Medição Representante. MVEC foram cultivadas em uma gelatina revestido matrizes 8W1E com baixa densidade de semeadura de 5.000 células / cm 2 e gravação de MFT foi realizado ao longo de 10 dias. A medição ilustra as diferentes leitura dos ECIS uma experiência: A) de adesão, de espalhamento e de proliferação, B) a formação e maturação de uma barreira de células confluentes, C) a cicatrização de feridas após a aplicação de uma ferida eléctrica; D) estimulação com o vasoactivo trombina agente. As duas setas indicam as médias bebidas, que foram realizadas em intervalos de 4 dias e dão uma idéia sobre a sensibilidade das medições para estímulos mecânicos e mudanças de temperatura e pH. As imagens do painel superior corresponde à medição e foram adquiridos directamente a partir do eléctrodo de medição. A imagem de contraste de fase da esquerda mostra as células endoteliais 24 horas após a inoculação, iniciando-se a cobrir o eléctrodo. As imagens de imunofluorescência, no centro e no presente coloração de F-actina direita da camada endotelial confluente antes e depois da estimulação com trombina (1 U / ml). A trombina causa a contração das células endoteliais pela formação das chamadas fibras de estresse ea abertura transitória de lacunas inter-endoteliais (setas e inserções de imagens), reconhecíveis no sinal ECIS por uma queda na resistência à linha de base. Aqui, a sensibilidade da medida torna-se evidente e como alterações na camada de células correlacionam-se com o sinal de impedância.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3. A adesão celular e crescimento. MVEC do mesmo dador foram semeadas com três diferentes densidades de gelatina revestida matrizes 8W10E e crescimento das células foi gravada em múltiplas frequências de 60 horas. A) Os valores de resistência para as três condições a sua frequência óptima de 4 kHz a medir formação de barreira. Todas as três densidades de semeadura estabelecida uma barreira confluente de ca. 1200 Ω no final da medição;. As taxas de proliferação no entanto (inclinações das curvas) diferem acentuadamente B) Medição de capacitância em 64 kHz fornece insights sobre a adesão e se espalhando. A adesão é o defase de plateau itial na curva de capacitância (entre 2-8 horas). Espalhar, que é linear em relação ao eléctrodo de cobertura, é representada pela inclinação da curva e é completada após 10-30 horas, dependendo da densidade de sementeira. O tempo ponto t 1/2 (metade cobertura máxima) pode ser usado para análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4. Caracterização da barreira confluente. Dois doadores MVEC com diferentes números de passagem (passagem 3 e 6) foram semeadas em matrizes de gelatina revestida 8W1E e uma medição da MFT foi realizada durante 30 h, para caracterizar a barreira CE. UM) Resistência medições revelam que o doador mais jovem 1 tem uma maior resistência de ca. 11.000 Ω em comparação com o ca. 7.500 Ω do doador mais velho 2. AC) Os recursos de modelagem do ECIS têm sido usados para encontrar a causa da menor resistência. Modelando revelou uma Rb interacção célula-célula e comparável indicou uma interacção célula-matriz enfraquecida alfa como uma possível causa. D) RTC foi realizada para quantificar micromovimento dentro da camada de células confluentes por transformação de Fourier, em que a área sob a curva é proporcional a micromovimento . As análises dos espectros mostra menos micromovimento do doador mais velho e, assim, 2 apoiar o que já pode ser assumida a partir do sinal de resistência (menos variância). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 5 "fo: content-width =" 5 polegadas "fo: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/> Figura 5. A migração celular após ferimento eléctrica e os efeitos de estimulação de trombina. Gravações de impedância foram realizadas a 4 kHz, com máxima resolução temporal. UM) MVEC dador 1 foi utilizado na passagem 3 e 2 dadores de passagem 6 de gelatina revestida matrizes 8W1E e cultivadas até à confluência. Em seguida, uma ferida eléctrica foi criado através da aplicação de dois pulsos de 5 V, a 60 kHz, com uma duração de 20 segundos cada. O doador mais jovens mostraram uma melhor capacidade de feridas baseados em um fecho rápido da ferida (migração, declives das curvas) de cura e uma resistência mais elevada após a lesão em comparação com o doador mais velhos 2. B) HUVEC foram cultivadas em matrizes de gelatina revestida 8W10E. Após a confluência as células foram privadas de soro durante 1,5 h, substituindo o meio de cultura completo com meio basal com 1% de albumina do soro humano (HSA). Nósidade de meio simples com HSA é um passo crítico, uma vez que os componentes do soro de bloqueio da resposta a trombina. Assim que foi detectado um patamar estável de resistência, a trombina foi adicionada directamente aos poços e misturou-se cuidadosamente com uma pipeta de 200 uL. O efeito máximo da trombina é visível após 30 min, caracterizada por uma queda transiente em resistência à linha de base e um ca. 30-50% menor resistência após a recuperação. As células foram pré-incubadas ou com a quinase bloqueador Y-27632 Rho por 30 min ou o bloqueador foi adicionado 20, 30 ou 40 min após a adição de trombina, o que diminuiu o efeito da trombina imediatamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

Discussion

ECIS é uma excelente ferramenta para o rastreamento de propriedades eo comportamento das células, bem como para a quantificação dos efeitos de substâncias conhecidas e desconhecidas. Deste modo, as células são mantidas em condições padrão de cultura, de impedância pode ser monitorizada continuamente com uma alta resolução temporal e correlacionado com os sinais ópticos. Dessa forma, o ponto de tempo óptimo para as manipulações de células podem ser escolhidas com base no estado da célula morfológica e funcional. Infelizmente, esta resolução elevada medida vem com o preço que pequenas mudanças na temperatura, o pH ou a estimulação mecânica de células (variação média) irá influenciar o sinal de impedância imediatamente.

A aplicação da pequena corrente de medição para as células faz com que a medição não invasiva ECIS, não destrutiva, e sem rótulo, mas como resultado apenas propriedades bioelétricas passiva pode ser medido (sem potenciais de ação). Uma característica importante é que um número de parâmetros podem ser der IVED a partir de uma única medida, combinando as informações de vários ensaios clássicos, como permeabilidade ou ensaios de cicatrização de feridas. Aqui o aspecto interessante é determinado que os dados modelados matematicamente pode ser utilizada para explorar as alterações na resistência e capacitância e encaminhá-los para diferentes estruturas celulares (por exemplo, de células-contactos ou de membrana celular). Importante notar é que espectroscopia de impedância sempre fornece um sinal de média entre todas as células no eletrodo de detecção, que não permite estudos sobre células individuais e também o modelo matemático é válido apenas em camadas de células confluentes. Portanto, as células endoteliais deve ser mantido no estado confluente por pelo menos um dia antes usado para a modelagem para garantir células-aderências maduras e células quiescentes. Igualmente, as feridas eléctricos só devem ser aplicados a confluentes camadas de células usando vários pulsos ferindo curtas com altas frequências, para alcançar a eficiência ferimento ideal e evitar danos dos eletrodos.

jove_content "> Para obter a máxima quantidade de informação a partir de uma medição da ECIS, como em todos os ensaios, de vários parâmetros, tais como a combinação de substrato de matriz, revestimento e densidade de sementeira para o tipo de célula individual necessita de ser testada e optimizada antes de uma experiência.

Uma das principais limitações da ECIS é que a medida não fornece informações diretas sobre o nível molecular. Assim, as medições ECIS são geralmente mais informativa no início de uma série experimental para ajudar a associar um problema científico com as estruturas celulares ou propriedades e proporcionar uma contribuição significativa para a geração de uma hipótese testável. Portanto, o design modular do ECIS fornece um amplo espectro de aplicações, com a possibilidade de sob medida matrizes. Os últimos desenvolvimentos da matriz indicam um foco futuro em exames de impedância de alto rendimento para a proliferação celular e ferindo elétrica eo avanço de matrizes de fluxos especiais para a simulação de in vivo </em> tensão de cisalhamento com diferentes perfis de fluxo.

Referências literárias
Por favor, consulte também a página de Biofísica Aplicadas (www.biophysics.com) para notas de aplicação, webinars e uma lista detalhada de publicações que cobrem todo o espectro ECIS.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Charles Keese, Dr. Christian Renken, Christian Dehnert (Applied BioPhysics Inc.) e Dr. Ulf Radler (Ibidi GmbH) para os seus conselhos, ajuda e as discussões frutíferas durante a preparação deste manuscrito. Além disso, gostaríamos de agradecer a Jan van Bezu pelo seu excelente suporte técnico.

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Distributor Europe	Catalog Number	Comments/Description
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	71617	http://www.biophysics.com/products-ecisz0.php
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70004	http://www.biophysics.com/cultureware.php
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70001	http://www.biophysics.com/cultureware.php
8W10E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Munich, Germany	70010	http://www.biophysics.com/cultureware.php
L-Cystein	Merck Millipore	–	102838	http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/l-cystein/MDA_CHEM-102838/p_GLOb.s1L7V8AAAEWL.EfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=L-cystein&BackButtonText=search+results
Gelatin	Merck Millipore	–	104070	http://www.merckmillipore.com/germany/chemicals/gelatine/MDA_CHEM-104070/p_S7Wb.s1LadYAAAEWaOEfVhTl?WFSimpleSearch_NameOrID=gelatine&BackButtonText=search+results
Bovine Thrombin	Merck Millipore	–	604980	http://www.merckmillipore.com/germany/life-science-research/thrombin-bovine-high-activity/EMD_BIO-604980/p__pmb.s1LNsYAAAEWS2IfVhTm?PortalCatalogID=merck4biosciences
Albuman (Human Serum Albumin)	Sanquin	–		http://www.sanquin.nl/en/products-services/plasma-products/
Y-27632	Tocris Biosciences	–	1254	http://www.tocris.com/dispprod.php?ItemId=1382#.UbiFNNish8E
EGM-2 BulletKit	Lonza	–	CC-3162	http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/endothelial-cell-growth-media-kits.aspx
Pen/Strep	Lonza	–	17-602E	http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx

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Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility. J. Vis. Exp. (85), e51300, doi:10.3791/51300 (2014).

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