内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

実験のセットアップは非常に簡単で、測定自体は、完全に自動化されたが、多くの場合そうであるように、正確な分析とデータの解釈は非常に重要である。代表的なデータセクションにガイドはECISとのインピーダンス分光法によって提供される最も重要なパラメータの解釈のために設けられている。これは、留学生センターの測定が有用であることができ、どのパラメータが記録されるべき科学的な問題のようなもののために決定されると参考になります。 典型的な実験の読み出しは、通常、細胞接種し、細胞がコンフルエントに達するプラトーフェーズの後の成長フェーズに分けることができます。これらのフェーズは、それぞれ異なる細胞特性に関する情報を得られます。代表的な測定は、 図2に示すA）、細胞接着を分析するために4つのサブフェーズに分割し、拡散および増殖され、成熟EC障壁のB）形成、C）細胞遊走電気を生成した後ら傷、およびD）、血管作用薬トロンビンでの刺激に対する細胞応答。位相コントラストおよび免疫蛍光画像は、電極被覆、細胞状態、および記録されたインピーダンス信号の間のリンクを説明するために、異なるサブフェーズの間、測定電極から直接取得した。 接着、拡散および増殖すべての細胞型は、細胞外マトリックスタンパク質または他の刺激によるコーティング、播種密度を変えることによって操作することができる特徴的な接着および増殖曲線を有する。これらのプロセスを研究するための主要な困難の一つは、拡散および増殖、接着性を区別することである。ウェゲナーら 11は、これらのパラメータを区別するための抵抗と容量の組み合わせの使用のための詳細な記述を与え、 図3に、抵抗と静電容量が互いに補完できるかが明らかになる。それがために重要である接着およびここに電界がセルの周囲に排他的に流れるように電流を強制的にサスペンション8中の細胞の細胞膜の分極を引き起こすため、測定周波数の影響を理解するために、拡散の研究。細胞は、それらが電極（小数部分）に開口面積の割合で直線的に電極と静電容量が減少する上で拡散することにより、電流の流れを制限し始めるときに取り付ける。容量の低下は、電極被覆に比例する直接的では40kHz（ 図3B）、より高い周波数での容量を記録する際従って、接着、拡散および増殖は、最良定量することができる。あるいは、その最も敏感な測定周波数における抵抗がコンフルエント関門（ 図3A）への細胞の分化および成熟のための直接的な尺度である。部分的な区域に加えて、ウェゲナーらは、他の二つを導入t 1/2は電極の50％が細胞（ 図3B、挿入）で覆われるまでの時間である（最大値の半分の容量）と、静電容量曲線（複数ではなく、勾配：接着および電極のカバレッジを定量化するパラメータ細胞拡散および増殖の速度など）を示す。 バリア品質の尺度としての抵抗抵抗は、膜、電極および媒体から容量成分を無視しているため、バリアの品質と最高の機能を説明し、インピーダンスの一部です。透過性は、定義ごとに細胞 – 細胞接触にのみ依存するので、ここで用語バリア品質ではなく、透過性は、使用される。しかし、抵抗は、電流の流れを遮断する細胞およびそれらの細胞 – 細胞および細胞 – マトリックス相互作用の能力によって決定される。従って、異なる細胞型（クローンおよび継代）は、それらの固有抵抗値（ 図4A）を有する。抵抗はあまりクレアを与えるが細胞障壁に関するRERのアイデアは、インピーダンス信号を常に考慮しなければならない。 Rbおよびアルファのモデル化 ECISソフトウェアは、特定の特徴、細胞-細胞および細胞-マトリックス接着（ 図4Bおよび4 C）を区別つのパラメータをモデル化する能力を保有する。 Rbは（CM 2×オームで）、電流の流れ、それによって古典透過性の逆指標に細胞間接触の抵抗である。高Rbは、電流の流れに向けて、低透過性を示唆している。アルファ（中センチメートル×0.5オーム）、細胞-電極接合に起因するインピーダンスの貢献のための尺度である。細胞-細胞および細胞-マトリックス接触を定量化するモデルがイェーヴァーとKeeseによって1991年に導入し、細胞を、絶縁膜を有する円形のディスク状のオブジェクトであるという仮定に基づいて、電極の上に置いて、電解質2導電性で満たされている。ザ·高い測定周波数が使用される場合にのみ可能性（細胞 – 細胞接触の間にb）は、a）の腹側細胞の表面と電極との間、及びc）細胞を介して：細胞膜電流のための唯一の3つの経路を残すの絶縁性）。より詳細な導出は、説明をローら 3,12の論文に記載されています。 微動なお、抵抗値信号（ 図4A）の小さな変動がコンフルエントな細胞層の微妙な、ランダムな細胞の動きに起因するだけでなく、細胞が培養スパース2の電極オンオフ移動することが示されている。ローとオップらによって記載留学生センターの経時的データのこの側面。13,14は見落とされがちと1Eアレイとし、パラおよび細胞内の電流の経路を説明するために最も敏感な周波数で測定する場合に最もよく見られます。このセルの計算は、ノイズ（微動）が目の一部ではない原因とE標準測定ソフトウェア、最新のバージョンでは、高速フーリエ変換（FFT）が統合されていますが。 4 kHzで1時間、1 [Hz]のサンプリング周波数でRTCデータを記録するEC微動の計算のための十分な解像度を提供する。この計算は、単一の値を提供し、直接統計分析のために使用することができる。微動の周波数分析の使用の拡張の議論は他の場所で15見つけることができます。代替的に、他のFFT解析戦略がインクリメントの分散と同様に、使用することができる。分散が微動の小さな変化に対してより敏感であるが、このために、感度の個々の実験の比較が困難になる。パワースペクトルの傾きが微動のよりロバストな測定（ 図4D）である。ここで、曲線下面積は、細胞が作成微動やノイズ量と見なすことができる。したがって、急峻なパワースペクトルの傾きの曲線下面積より小さいと微動小さい。 電気創傷治癒アッセイ細胞の移動を研究するために、通常は機械的な傷は、ピペットチップ、細胞スクレーパーまたは特定のスタンプを培養プレートから細胞を傷つけ、顕微鏡で16彼らの再マイグレーションに従うことで適用されます。この方法は、傷の大きさが変化し、通常、創傷治癒過程に細胞増殖の影響を無視するには大きすぎる明らかな欠点を有する。留学生センターの創傷機能は、無細胞電極を得るために、高電圧、高周波パルスを使用し、その後、死細胞（ 図5A）を交換する隣接セルの再マイグレーションをたどる。標準、労働集約的なスクラッチアッセイより、この自動化された方法の利点は、留学生センターが純粋な移行を研究するために、数時間以内に閉じ250μmの正確な直径を有する再現性の高い傷を生成することである。さらに、電気的なパルスがやるESタンパク質コーティングされ、分泌細胞外マトリックスを削除しない。細胞はすべての側面から電極上に再移行すると仮定して、移動速度を容易に創傷閉鎖17するのに要する時間によって巻き半径で割ることにより算出することができる。電気的な創傷の代替として、最近、いわゆる電気柵方法が導入された（図示せず）。ここでは、高電流パルスが接種後電極上の細胞の接着や移動を防ぐ。細胞は、測定電極の周囲に成長し、内向きにするとすぐに電気パルスがオフになっているように移行を開始します。電動創傷上に電気柵の利点は、電極表面が細胞増殖または細胞遊走に対する異なるコーティングの影響を測定することが重要である細胞を除去することによって変更されていないことである。 細胞刺激細胞移動の研究に加えて、インピーダンス分光法は、完全に適している薬や細胞への毒素の影響を測定します。 図5Bは、トロンビンは抵抗の一過性の低下として現れる細胞の収縮とギャップ形成によりコンフルエントのEC障壁のHyper-透過性を誘導するために使用された古典的な刺激/阻害実験を提示。 Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632とのプレインキュベーションによりトロンビン応答の大部分が、基底細胞張力18を下げ、ストレスファイバー形成19を遮断することによって減少する。次いで、RhoキナーゼブロッカーEC障壁の即時および総回収率につながる、トロンビン添加後の異なる時点で使用した。ここでは、急性細胞応答を研究するための連続的なインピーダンス測定システムの利点は明らかとなる。正規のエンドポイントアッセイ（ 例えば免疫蛍光染色または高分子通路）で、使用ブロッカーこの急性反応を検出および定量化することは非常に困難不可能ではないだろう。注意することが重要であることで、私mpedance測定は、イオンに対して透過性は、巨大分子の方に説明されていません。留学生センターの測定および高分子通路実験との間の優れた比較が提供されアマンら 20を参照されたい。 図2。代表的な測定。MVEC 5,000細胞/ cm 2とMFT記録を10日間にわたって実施した低播種密度でゼラチン被覆された8W1Eアレイ上で増殖させた。測定は、留学生センターの実験の異なる読み出しアウトを示しています。A）の接着、拡散および増殖を、B）形成とコンフルエント細胞障壁の成熟と、c）創傷治癒の電気傷を適用した後、血管作動性を持つD）刺激エージェントのトロンビン。 2矢印は、メディアを示している 4日の間隔で行われ、機械的刺激、温度やpHの変化に向けた測定の感度についてのアイデアを与えるた軽食、。トップパネルの画像は、測定に対応し、測定電極から直接取得した。左側の位相差画像は、電極を覆うように出発して、接種24時間後、内皮細胞を示す。センター内およびトロンビ​​ン（1単位/ ml）で刺激前後のコンフルエント内皮層の右現在、F-アクチン染色に免疫蛍光写真。トロンビンは、ベースラインへの抵抗の低下による留学生センター信号で認識、いわゆるストレスファイバーとインター内皮ギャップ（矢印や画像の挿入）の過渡開口部を形成することにより、内皮細胞の収縮を引き起こす。ここでは、測定の感度が明らかになり、どのように細胞層の変化はインピーダンス信号と相関する。s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図3。細胞付着および成長。MVECは、同じドナーからゼラチンコート8W10Eアレイおよび細胞増殖が60時間のために複数の周波数で記録された3つの異なる密度で播種した。A）が4kHzのそれらの最適域の3つの条件に対する抵抗値を測定することバリア形成。すべての3つの播種密度は、CAの集密障壁を設置しました。測定終了時1200Ωはいるが、増殖率（曲線の傾き）が大きく異なるB）の静電容量の測定を64 kHzでは、密着性および拡散についての洞察を提供しています。接着は中です（2-8時間の間）の容量曲線のitialプラトー相。電極カバレージに対して線形関係にある、拡散、曲線の傾きによって表され、播種密度に依存して10〜30時間後に完了する。時刻t 1/2（半最大カバレッジ）は、統計解析のために使用することができます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 図4。異なる継代数でコンフルエントバリアの特徴付け。つMVECドナー（継代3および6）ゼラチンコート8W1Eアレイ上に播種し、MFT測定はEC障壁を特徴付けるために、30時間撹拌を行った。A）抵抗測定は、若いドナー1は、約高い抵抗を有することを明らかにした。 カリフォルニア州と比較して11,000Ω。古いドナー2の7,500Ω。BC）留学生センターのモデリング機能は、低抵抗化のための原因を見つけるために使用されている。モデリングは、同等の細胞-細胞相互作用Rbが明らかになったと考えられる原因として弱められた細胞-マトリックス相互作用アルファを示した。D）RTCは、曲線下面積は、微動に比例するフーリエ変換によってコンフルエント細胞層、内微動を定量するために実施した。スペクトルの分析は、それ以上の年齢のドナー2の少ない微動を示し、それによって、すでに抵抗信号（少ない分散）から想定することができるものをサポートしています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 5 "FO：コンテンツの幅=" "FO：SRC =" 5インチ/ files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/> 図5。細胞移動は、電気創傷およびトロンビン刺激の効果の後に。インピーダンス記録が最大時間分解能で4 kHzで行われた。A）MVECドナー1が通路3とゼラチンコート8W1Eアレイ上の通路6におけるドナー2で使用し、コンフルエンスまで増殖した。その後、電気的な傷は、20秒ごとの持続時間が60 kHzで2 5 Vのパルスを印加することで作成されました。若いドナー1は、HUVECをゼラチンコート8W10Eアレイ上で成長させた）古いドナー2。 のBと比較してより高速な創傷閉鎖（マイグレーション、曲線の傾き）に基づいて機能を回復、より良い傷や創傷後に高い抵抗性を示した。コンフルエンス時に細胞が血清基礎培地+1％ヒト血清アルブミン（HSA）を含む完全培地を交換して1.5時間飢餓状態にされている。私達血清成分は​​トロンビン応答をブロックするので、HSAと平野媒体の年齢は、重要なステップです。とすぐに安定した抵抗プラトーが検出されたように、トロンビンをウェルに直接添加し、そして200μlのピペットで注意深く混合した。最大トロンビン効果は、ベースラインとCAへの抵抗の一過性の低下によって特徴付けられる、30分後に表示されている。回復後の30から50までパーセント低い抵抗。細胞はどちらか30分以上遮断のためのRhoキナーゼ阻害薬Y-27632でプレインキュベートした20、30、またはすぐにトロンビン効果が減少トロンビンを添加した後40分を加えた。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 。