Elettrico Cell-substrato Impedance Sensing per la quantificazione dei Endothelial proliferazione, Barriera funzione e motilità

Impostazione di un esperimento è abbastanza semplice e la misura stessa è completamente automatico, ma, come spesso accade, l'analisi e l'interpretazione dei dati corretti sono cruciali. Nella sezione dati rappresentante una guida è previsto per l'interpretazione dei parametri più importanti forniti mediante spettroscopia di impedenza con ECIS. Questo sarà utile per decidere per quale tipo di problema scientifico una misura ECIS può essere utile e quali parametri devono essere registrati. Un tipico sperimentale read-out può essere generalmente divisa in crescita fase dopo l'inoculazione cellulare e un plateau fase quando le cellule raggiungono confluenza. Ciascuna di queste fasi cede informazioni sulle diverse proprietà cellulari. Una misurazione rappresentativo è mostrato in Figura 2 e diviso in quattro sottofasi di analizzare A) adesione cellulare, diffusione e proliferazione; B) formazione di una barriera maturazione CE; C) la migrazione delle cellule dopo la generazione di un elettricoAl ferita e D), la risposta cellulare alla stimolazione con trombina agente vasoattivo. Immagini a contrasto di fase e di immunofluorescenza sono stati acquisiti direttamente dall'elettrodo di misura durante le diverse sottofasi per illustrare il collegamento tra la copertura elettrodo, lo stato della cella, e impedenza segnale registrato. Adesione, la diffusione e la proliferazione Ogni tipo di cellula ha la sua curva caratteristica di adesione e la crescita che può essere manipolata variando densità di semina, rivestimento con proteine ​​della matrice extracellulare o altri stimoli. Una delle maggiori difficoltà per studiare tali processi è quello di distinguere tra adesione, diffusione e proliferazione. Wegener et al 11. Ha dato una descrizione dettagliata per l'utilizzo di una combinazione di resistenza e capacità di distinguere tra questi parametri e nella figura 3 appare evidente come resistenza e capacità possono completarsi a vicenda. E 'importante perlo studio di adesione e diffusione di comprendere l'influenza la frequenza di misurazione, perché qui il campo elettrico provoca una polarizzazione della membrana cellulare delle cellule in sospensione 8, che forza il passaggio della corrente esclusivamente intorno alle cellule. Quando le cellule si attaccano cominciano a limitare il flusso di corrente attraverso la diffusione negli elettrodi e capacità diminuisce in modo lineare con la percentuale di area aperta sull'elettrodo (area frazionaria). Quindi, l'adesione, la diffusione e la proliferazione possono essere quantificati meglio, quando si registra capacità ad una frequenza superiore a 40 kHz (Figura 3B), dove la diminuzione di capacità è proporzionale alla copertura dell'elettrodo. In alternativa resistenza alla frequenza di misurazione più sensibile è una misura diretta per la differenziazione e la maturazione delle cellule in una barriera confluenti (Figura 3A). Oltre alla zona frazionaria, Wegener et al. Illustra due diversiparametri per quantificare l'adesione e la copertura elettrodo: t 1/2 (capacitanza metà del massimo), che è il tempo fino al 50% dell'elettrodo è ricoperta da cellule (Figura 3B, inserzione), e la pendenza della curva di capacità (s, non mostrato) come il tasso di diffusione e proliferazione cellulare. Resistenza come misura della qualità barriera La resistenza è la parte di impedenza che descrive qualità e la funzione barriera migliore, perché trascura componenti capacitivi dalla membrana, elettrodo e medie. Qui viene usato il termine qualità barriera e non permeabilità, poiché permeabilità è per definizione dipende solo contatti cellula-cellula. Resistenza tuttavia è determinata dalla capacità delle cellule e le loro interazioni cellula-cellula e cellula-matrice di bloccare il flusso di corrente. Di conseguenza diversi tipi di cellule (cloni e passaggi) hanno i loro valori di resistenza specifici (Figura 4A). Sebbene resistenza consente un più Clearer idea sulla barriera cella, il segnale impedenza deve essere preso in considerazione. Modellazione di Rb e Alpha Il software ECIS nutre una particolare funzione, la possibilità di modellare due parametri, che distinguono tra cellula-cellula e cellula-matrice aderenze (figure 4B e 4 C). Rb (in cm x 2 ohm), è la resistività dei contatti cellula-cellula al flusso di corrente e quindi una misura inversa della permeabilità classica. Alta Rb implica bassa permeabilità verso il flusso di corrente. Alpha (in cm x 0,5 ohm), è una misura per i contributi impedenza derivanti dalle giunzioni cellula-elettrodo. Il modello per quantificare cellula-cellula e cellula-matrice contatti è stato introdotto 1991 da Giaever e Keese e si basa sul presupposto che le cellule sono circolari, oggetti discoidali che hanno una membrana isolante, Passa sopra l'elettrodo e sono pieni di condurre elettrolita 2 . IlIl potere isolante della membrana cellulare lascia solo tre vie per la corrente: a) tra la superficie ventrale delle cellule e elettrodo, b) tra i contatti cellula-cellula e c) attraverso le cellule (probabile solo quando viene utilizzato un elevata frequenza di misura ). Una derivazione più dettagliate e spiegazioni possono essere trovati nelle carte di Lo et al 3,12. Micromotion E 'stato dimostrato che piccole fluttuazioni nel segnale resistenza (Figura 4A) sono causa di sottili movimenti delle cellule casuali, in strati di cellule confluenti così come le cellule si spostano e disattivare l'elettrodo in culture sparse 2. Questo aspetto della ECIS dati in tempo portate descritte da Lo e Opp et al. 13,14 è spesso sottovalutato e vede meglio quando si misura con i 1E matrici e alla frequenza più sensibile per spiegare attuali percorsi subcellulare-para e. Il calcolo di questa cella causato rumore (micromovimenti) non è parte del secoloe software di misura standard, anche se nella nuova versione è integrata Fast Fourier Transformation (FFT). Registrazione dati RTC con una frequenza di campionamento di 1 Hz per 1 ora a 4 kHz fornisce una risoluzione sufficiente per il calcolo di micromovimenti CE. Questo calcolo fornisce un singolo valore e può essere utilizzato direttamente per l'analisi statistica. Una discussione estesa sull'uso di analisi in frequenza per micromovimenti può essere trovato altrove 15. In alternativa a FFT altre strategie di analisi possono essere utilizzati, come varianza degli incrementi. La varianza è più sensibile a piccole variazioni di micromovimenti, ma a causa di questa sensibilità del confronto dei singoli esperimenti diventa difficile. Le piste dello spettro di potenza sono una misura più robusta di micromovimenti (Figura 4D). Qui l'area sotto la curva può essere visto come la quantità di micromovimenti o rumore cellule creano. Quindi, maggiore è la pendenza dello spettro di potenza minore è l'area sotto la curvae minore è la micromovimenti. Elettrico test guarigione delle ferite Per studiare la migrazione delle cellule, le ferite di solito meccaniche sono applicati da graffi cellule dalla piastra di coltura con punte per pipette, raschietti cellulari o francobolli specifici e seguire la loro remigration microscopicamente 16. Questo metodo ha lo svantaggio evidente che le dimensioni del graffio varia e di solito è troppo grande per trascurare l'influenza della proliferazione cellulare sul processo di guarigione delle ferite. La funzione ferendo della ECIS utilizza una tensione elevata, impulso ad alta frequenza per ottenere un elettrodo acellulare e successivamente segue remigration di cellule vicine per sostituire le cellule morte (Figura 5A). Un vantaggio di questo metodo automatizzato su standard di manodopera saggi scratch è che la ECIS produce una ferita altamente riproducibile con un preciso diametro di 250 micron, che chiude in poche ore, per studiare la migrazione puro. Inoltre, l'impulso elettrico does Non rimuovere il rivestimento proteico e matrice extracellulare secreta. Partendo dal presupposto che le cellule remigrate sull'elettrodo da tutti i lati, il tasso di migrazione può essere facilmente calcolato dividendo raggio avvolto da tempo necessario per la chiusura della ferita 17. In alternativa al ferimento elettrico, recentemente è stato introdotto il cosiddetto metodo recinto elettrico (non mostrato). Qui elevati impulsi di corrente prevenire la fissazione e la migrazione delle cellule sugli elettrodi dopo l'inoculazione. Le cellule cresceranno intorno all'elettrodo di misura e avviare la migrazione verso l'interno appena gli impulsi elettrici sono spenti. Il vantaggio della recinzione elettrica sopra il ferimento elettrica è che la superficie dell'elettrodo non è stato alterato dalla crescita cellulare o la rimozione delle cellule, che è importante misurare influenze di diversi rivestimenti su migrazione cellulare. Stimolazione cellulare Oltre allo studio della migrazione cellulare, spettroscopia di impedenza è perfettamente adatto permisurare gli effetti dei farmaci e tossine sulle cellule. Figura 5B presenta un esperimento di stimolazione / inibizione classica, in cui la trombina è stato usato per indurre iper-permeabilità nel confluente barriera CE per contrazione e gap formazione di cellule, che si manifesta come una riduzione transitoria della resistenza . Dalla preincubazione con l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 più della risposta trombina viene ridotto mediante abbassamento della tensione basocellulare 18 e bloccando formazione di fibre di stress 19. Poi la chinasi Rho bloccante è stato usato a tempi diversi dopo aggiunta di trombina, che porta ad un recupero immediato e totale della barriera CE. Qui il vantaggio di un sistema di misurazione continua dell'impedenza per studiare le risposte cellulari acute diventa evidente. In saggi endpoint regolari (ad esempio colorazione immunofluorescenza o passaggio macromolecola), questa risposta acuta allo bloccante utilizzato sarebbe molto difficile se non impossibile da rilevare e quantificare. Importante da notare è che con imisurazioni mpedance la permeabilità verso ioni è descritto e non verso macromolecole. Si prega di fare riferimento al Aman et al. 20, dove è previsto un ottimo confronto tra le misure ECIS e gli esperimenti di passaggio macromolecola. Figura 2. Misurazione rappresentativa. MVEC sono state coltivate su una gelatina rivestite array 8W1E a bassa densità di semina di 5.000 cellule / cm 2 e la registrazione MFT è stata effettuata più di 10 giorni. La misurazione illustra le diverse letture dei un esperimento ECIS: A) adesione, diffusione e proliferazione; B) formazione e la maturazione di una barriera cellula confluente; C) guarigione della ferita dopo l'applicazione di una ferita elettrica; D) la stimolazione con il vasoattivo trombina agente. Le due frecce indicano medio rinfresco, che sono stati eseguiti in intervalli di 4 giorni e danno un'idea della sensibilità delle misurazioni verso stimoli meccanici e variazioni di temperatura e di pH. Le immagini nel pannello superiore corrispondono alla misurazione e sono stati acquisiti direttamente dall'elettrodo di misura. L'immagine a contrasto di fase a sinistra mostra le cellule endoteliali 24 ore dopo l'inoculo, iniziando a coprire l'elettrodo. Le immagini di immunofluorescenza del centro e sulla destra attuale colorazione F-actina dello strato endoteliale confluenti prima e dopo stimolazione con trombina (1 U / ml). Trombina causa contrazione di cellule endoteliali mediante formazione di stress fibers cosiddetti e l'apertura transitoria di lacune inter-endoteliali (frecce ed inserti di immagine), riconoscibili nel segnale ECIS da una caduta di resistenza al basale. Qui la sensibilità della misura diventa evidente e come cambiamenti nel livello di cella correlata al segnale di impedenza.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Attaccamento cellulare e la crescita. MVEC dallo stesso donatore sono stati seminati con tre diverse densità sulla gelatina rivestita array 8W10E e crescita cellulare è stata registrata a frequenze multiple per 60 hr. A) I valori di resistenza per le tre condizioni al loro frequenza ottimale di 4 kHz per misurare formazione di barriera. Tutte e tre le densità di semina stabilito una barriera confluente di ca. 1.200 Ω al termine della misura,. Tassi di proliferazione comunque (pendenze delle curve) si differenziano nettamente B) Misura di capacità a 64 kHz fornisce approfondimenti sulla adesione e la diffusione. L'adesione è l'initial fase di plateau nella curva di capacità (tra 2-8 ore). Diffusione, che è in relazione lineare alla copertura dell'elettrodo, è rappresentato dalla pendenza della curva e si completa dopo 10-30 ore a seconda della densità di semina. Il tempo punto t 1/2 (copertura metà massima) può essere utilizzato per l'analisi statistica. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. Caratterizzazione della barriera confluente. Due donatori MVEC con diversi numeri di passaggio (passaggio 3 e 6) sono state seminate su gelatina rivestita array 8W1E e una misurazione MFT è stata eseguita per 30 h per caratterizzare la barriera CE. A) Resistenza misurazioni rivelano che il donatore più giovane 1 ha una resistenza maggiore di ca. 11.000 Ω rispetto al ca. 7.500 Ω del donatore più anziano 2. AC) Le funzionalità di modellazione della ECIS sono stati utilizzati per individuare la causa del minore resistenza. Modeling rivelato un comparabile interazioni cellula-cellula e Rb indicata una interazione cellula-matrice indebolito Alpha come possibile causa. D) RTC è stata eseguita per quantificare micromovimenti all'interno dello strato di cellule confluenti da trasformazione di Fourier, in cui l'area sotto la curva è proporzionale micromovimenti . Le analisi degli spettri mostra meno micromovimenti del donatore più anziano 2 e, quindi, sostenere quello che può già essere assunto dal segnale di resistenza (meno varianza). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. 5 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/> Figura 5. La migrazione cellulare dopo ferimento elettrica e gli effetti della stimolazione trombina. Registrazioni impedenza sono stati eseguiti a 4 kHz con una risoluzione temporale massima. A) MVEC donatore 1 è stato utilizzato nel passaggio 3 e donatore 2 in passaggio 6 su gelatina rivestita array 8W1E e cresciuto a confluenza. Poi una ferita elettrica è stata creata mediante l'applicazione di due impulsi 5 V a 60 kHz con una durata di 20 secondi ciascuno. Il donatore più giovane 1 ha mostrato una migliore capacità di guarigione della ferita in base a una più rapida chiusura della ferita (migrazione, pendenze delle curve) e una maggiore resistenza dopo ferendo rispetto al donatore di età superiore 2. B) HUVEC sono state fatte crescere su gelatina rivestita array 8W10E. Su confluenza le cellule sono state affamate di siero per 1,5 hr sostituendo il terreno di coltura completo di mezzo di base più 1% di albumina sierica umana (HSA). Noietà media pianura con HSA è una fase critica, poiché i componenti del siero bloccano la risposta trombina. Non appena un plateau resistenza stabile è stato rilevato, la trombina è stata aggiunta direttamente ad ogni pozzetto e miscelato accuratamente con una pipetta 200 microlitri. L'effetto massimo trombina è visibile dopo 30 min, caratterizzata da una riduzione transitoria della resistenza al basale e un ca. Inferiori del 30-50% di resistenza dopo il recupero. Le cellule sono state pre-incubate sia con il Rho chinasi bloccante Y-27632 per 30 minuti o il blocco sono stati aggiunti 20, 30, o 40 minuti dopo trombina, inoltre, che diminuisce l'effetto della trombina immediatamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .