חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

הגדרת ניסוי היא פשוט למדי והמדידה עצמו באופן אוטומטי לחלוטין, אבל כמו שקורה לעתים קרובות, ניתוח ופרשנות של נתונים נכונים הם קריטיים. במקטע נתוני נציג מדריך מסופק לפרשנות של הפרמטרים החשובים ביותר הניתנים על ידי ספקטרוסקופיה עכבה עם ECIS. זה יהיה מועיל כדי להחליט לאיזה סוג של בעיה מדעית מדידת ECIS יכולה להיות שימושית ואשר אמורים להיות מוקלטים פרמטרים. קריאה מתוך ניסיוני אופייני בדרך כלל ניתן לחלק בצמיחה בשלב לאחר חיסון תא ורמת שלב כאשר תאים מגיעים למפגש. כל אחד מהשלבים הללו מניב מידע על נכסים סלולריים שונים. מדידת נציג מוצגת באיור 2 ומחולקת לארבעה שלבי משנה לנתח הידבקות תא), הפצה והתפשטות; ב ') הקמת גדר EC התבגרות; C נדידת תאים) לאחר הדור של חשמלאל פצע; ו-D) התגובה התאית לגירוי עם תרומבין סוכן vasoactive. דימויים שלב בניגוד ו immunofluorescence נרכשו ישירות מהאלקטרודה המדידה במהלך שלבי המשנה השונים על מנת להמחיש את הקשר בין כיסוי אלקטרודה, מצב תא, ואות עכבה מוקלטת. הדבקה, הפצה והתפשטות לכל סוג תא עקומת ההידבקות וצמיחה האופיינית שלה, שניתן להשפיע על ידי שינוי צפיפות זריעה, ציפוי עם חלבוני מטריצת חוץ תאיים או גירויים אחרים. אחד הקשיים העיקריים ללמוד תהליכים אלה הוא להבדיל בין ההידבקות, הפצה והפצה. וגנר ואח' 11. נתן תיאור מפורט לשימוש בשילוב של התנגדות וקיבול להבחין בין הפרמטרים הללו ובאיור 3 זה הופך להיות ברור כיצד התנגדות וקיבול יכולים להשלים אחד את השני. חשוב ליהמחקר של הידבקות וההתפשטות להבין את ההשפעה של תדירות המדידה, כי כאן השדה החשמלי גורם לקיטוב של קרום התא של התאים בתרחיף 8, מה שמאלץ את הזרם לזרום באופן בלעדי סביב התאים. כאשר התאים לצרף הם מתחילים להגביל את הזרימה הנוכחית על ידי המשתרע על ירידות האלקטרודה וקבול בצורה ליניארית עם אחוז של שטח פתוח על האלקטרודה (אזור השבר). לפיכך, הדבקה, הפצה והתפשטות ניתן לכמת הטובים ביותר, בעת הקלטת קיבול בתדירות גבוהה יותר מאשר 40 קילוהרץ (איור 3), שבו הירידה בקיבול היא ישירה פרופורציונלית לכיסוי האלקטרודה. לחלופין התנגדות בתדירות המדידה רגישה ביותר שלה היא מדד ישיר לבידול וההתבגרות של תאים לתוך מחסום מחוברות (איור 3 א). בנוסף לאזור השבר, וגנר ואח'. הציג שני האחריםפרמטרים לכמת הידבקות וכיסוי אלקטרודה: t 1/2 (קיבול חצי לכל היותר), המהווה את הזמן עד 50% מאלקטרודה מכוסה בתאים (איור 3B, הכנסה), ושיפוע העקום הקיבול (ים, לא מוצג) כשיעור התא מתפשט והתפשטות. התנגדות כמדד לאיכות מחסום התנגדות היא חלק מהעכבה שמתאר איכות מחסום ותפקוד הטוב ביותר, משום שהיא מזניחה את רכיבי קיבולי מהקרום, אלקטרודה ובינוני. כאן משמשת חדירות איכות גדר טווח ולא, שכן חדירות היא לפי הגדרה תלויה רק ​​באנשי קשר תא תא. עם זאת התנגדות נקבעת על ידי היכולת של תאים ותאי תאי האינטראקציות ותא המטריצה ​​שלהם כדי לחסום את הזרימה הנוכחית. יש סוגים שונים בהתאם לכך תא (שיבוטים ומעברים) את ערכיהם הספציפיים התנגדות (איור 4 א). למרות התנגדות נותנת הרבה קליאהרעיון RER אודות מכשול התא, אות העכבה תמיד צריכה להילקח בחשבון. דוגמנות של Rb ואלפא תוכנת ECIS נמלי תכונה מסוימת, את היכולת למודל שני פרמטרים, אשר מבדילים בין הידבקויות תאי תאים ותא מטריצה ​​(4B דמויות ו4 ג). Rb (בס"מ 2 אוהם x), הוא ההתנגדות של אנשי קשר תאי תאים לזרימת זרם ובכך מדד ההופכי של חדירות קלאסיות. Rb גבוה מרמז חדירות נמוכות לכיוון זרימת הזרם. אלפא (בx אוהם 0.5 סנטימטר), הוא מדד לתרומות עכבה הנובעות מצומת התא-אלקטרודה. המודל לכמת קשר תאי תאים ותא מטריצה ​​הוצג 1991 על ידי Giaever וKeese והוא מבוסס על ההנחה שהתאים עגולים, חפצי דיסק בצורה שקרום בידוד, ירחף מעל האלקטרודה ומלאות בניצוח אלקטרוליט 2 .בידוד רכושו של קרום התא משאיר רק שלושה מסלולים לנוכחיים: א) בין פני השטח הגחון של התאים ואלקטרודה, ב) בין אנשי קשר תאי תאים, וג) דרך התאים (רק סביר להניח שכאשר נעשה שימוש בתדירות גבוהה מדידה ). ניתן למצוא גזירה והסבר מפורטים יותר בעיתונים של Lo et al 3,12. Micromotion הוכח כי תנודות קטנות באות ההתנגדות (איור 4 א) הן תוצאה של תנועות עדינות, אקראיות תא בשכבות תאים ומחוברות, כמו גם תאים נעו לסירוגין את האלקטרודה בתרבויות דלילות 2. היבט זה של נתונים בזמן ECIS כמובן שתוארו על ידי Lo ומול et al. 13,14 הוא לעתים קרובות התעלם וטוב ביותר שנראה בעת המדידה עם 1E מערכים ובתדר רגיש ביותר כדי להסביר את סעיף ונתיבים שוטפים subcellular. החישוב של תא זה נגרם רעש (micromotion) אינו חלק של הדואר תוכנה סטנדרטית מדידה, אם כי בגרסה החדשה ביותר טרנספורמציה פורייה מהיר (FFT) משולבת. הקלטת נתונים RTC עם תדר דגימה של 1 הרץ עבור שעה 1 ב 4 קילוהרץ מספקת רזולוציה מספיקה לחישוב micromotion EC. חישוב זה מספק ערך אחד ויחיד והוא יכול לשמש באופן ישיר לניתוח סטטיסטי. ניתן למצוא דיון מורחב על השימוש בניתוח תדר עבור micromotion מקום אחר 15. לחלופין לFFT ניתן להשתמש באסטרטגיות ניתוח אחרות, כמו שונות של המרווחים. השונות היא רגישות יותר כלפי שינויים קטנים בmicromotion, אלא בגלל רגישות זו ההשוואה של ניסויים בודדים הופכת להיות קשה. המדרונות של ספקטרום הכוח הם מדידה חזקה יותר של micromotion (איור 4D). כאן השטח מתחת לעקומה ניתן לראות את כמות micromotion או רעש התאים ליצור. לפיכך, תלול המדרון של ספקטרום הכוח קטן יותר השטח מתחת לעקומהוקטן יותר micromotion. assay ריפוי פצע חשמלי ללמוד הגירה של תאים, פצעים בדרך כלל מכאניים מיושמים על ידי גירוד תאים מצלחת התרבות עם טיפים פיפטה, מגרדי תאים או בולים ספציפיים ולעקוב remigration מיקרוסקופי 16. בשיטה זו יש חסרון הברור שהגודל של השריטה משתנה ובדרך כלל הוא גדול מדי כדי להזניח את ההשפעה של התפשטות תאים בתהליך ריפוי פצע. פונקצית פציעתם של ECIS משתמשת במתח גבוה, דופק בתדירות גבוה כדי לקבל האלקטרודה חופשית תא ולאחר מכן כדלקמן remigration של תאי שכנים כדי להחליף את תאי המוות (איור 5 א). יתרונה של שיטה זו על פני אוטומטית סטנדרטית, מבחני שריטה עבודה אינטנסיבית הוא שECIS מייצר פצע שחזור מאוד בקוטר מדויק של 250 מיקרומטר, שסוגר בתוך כמה שעות, כדי ללמוד הגירה טהורה. יתר על כן, את הדופק החשמלי לעשותes לא תסיר את ציפוי חלבון ומטריצה ​​תאית מופרשת. בהנחה שהתאים remigrate על האלקטרודה מכל הצדדים, שיעור ההגירה יכול בקלות להיות מחושב על ידי חלוקת רדיוס פצע על ידי הזמן הנדרש לסגירת פצע 17. כחלופה לפציעתם חשמל, לאחרונה שיטת הגדר החשמלית שנקרא הוצגה (לא מוצג). פולסים הנוכחיים הנה גבוהים למנוע התקשרות והגירה של תאים על האלקטרודות לאחר חיסון. התאים יגדלו סביב האלקטרודה המדידה ולהתחיל נודדים פנימה ברגע שפולסים חשמליים כבויים. היתרון של הגדר החשמלית על פציעתם החשמלית הוא שפני האלקטרודה לא שונו על ידי צמיחת תאים או הסרת תא, וזה חשוב למדידת השפעות של ציפויים שונים על נדידת תאים. גירוי תא בנוסף לחקר נדידת תאים, ספקטרוסקופיה עכבה מתאימה בצורה מושלמת ללמדוד את ההשפעות של תרופות ורעלים בתאים. איור 5 מציג ניסוי גירוי / עיכוב קלאסי, שבו תרומבין נעשה שימוש כדי לגרום להיפר חדירות במחסום EC מחוברות ידי היווצרות התכווצות ופער של תאים, אשר באה לידי ביטוי בירידה זמנית בהתנגדות . על ידי preincubation עם מעכב קינאז Rho-Y 27632 ביותר של תגובת תרומבין הוא פחת על ידי הפחתת מתח של תאי בסיס 18 וחסימת היווצרות לחץ סיבי 19. אז חוסם קינאז Rho שימש בנקודות זמן שונות לאחר בנוסף תרומבין, שהוביל להתאוששות מיידית ומוחלטת של גדר EC. כאן היתרון של מערכת מדידת עכבה רציפה ללמוד תגובות הסלולר חריפות הופך להיות ברור. בנקודת סיום מבחני רגילים (מכתים למשל immunofluorescence או מעבר מקרומולקולה), תגובה חריפה זה לחוסם שימוש תהיה קשה מאוד אם לא בלתי אפשרית לזהות ולכמת. חשוב לציין הוא שעם iמדידות mpedance החדירות ליונים מתוארת ולא כלפי מקרומולקולות. נא עיין אמן אח'. 20, שם השוואה מצוינת בין מידות ECIS ניסויים מעבר מקרומולקולה מסופקת. איור 2. מדידה מייצגת. MVEC גדלו על מערכי 8W1E ג'לטין מצופה בצפיפות זריעה נמוכה של 5,000 תאים / 2 סנטימטר והקלטת MFT בוצעה מעל 10 ימים. המדידה ממחישה את הקריאה פסקי השונים של ניסוי ECIS:) הידבקות, הפצה והתפשטות; B) היווצרות והבשלה של מחסום תא מחוברות; גירוי D) עם vasoactive; ריפוי C) פצע לאחר היישום של פצע חשמלי תרומבין סוכן. שני החיצים מצביעים בינוניים כיבוד, אשר בוצעו במרווחים של 4 ימים ולתת מושג על הרגישות של המדידות לקראת גירויים ושינויי טמפרטורה וחומציות מכאניים. התמונות בלוח העליון מתאימות למדידה ונרכשו ישירות מהאלקטרודה המדידה. תמונת שלב בניגוד משמאל מראה את תאי האנדותל 24 שעות לאחר החיסון, החל לכסות את האלקטרודה. תמונות immunofluorescence במרכז ובצביעת F-אקטין הנוכחית הימנית של שכבת האנדותל המחוברות לפני ואחרי גירוי עם תרומבין (1 U / ml). תרומבין גורם להתכווצות של תאי האנדותל על ידי היווצרות של סיבי מתח שנקרא ופתיחה הזמנית של פערים בין אנדותל (חיצים ומוסיף תמונה), לזיהוי באות ECIS על ידי ירידה בהתנגדות לבסיס. הנה רגישות של המדידה הופך להיות ברור וכיצד שינויים בשכבת התאים לתאם עם אות העכבה.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3. מצורף תא והצמיחה. MVEC מאותו התורם היה זרע עם שלוש צפיפויות שונות על מערכי 8W10E ג'לטין מצופים וצמיחת תאים נרשמה בתדרים מרובים עבור 60 שעה.) ערכי התנגדות לשלושה התנאים בתדירות האופטימלית שלהם של 4 קילוהרץ למדוד היווצרות מכשול. כל שלוש צפיפויות הזריעה הוקמו מחסום ומחוברות של CA. 1,200 Ω בסוף המדידה;. שיעורי תפוצה עם זאת (מדרונות של העקומות) שונים במידה ניכרת ב ') מדידת הקיבול ב64 kHz מספקת תובנות על הידבקות ומתפשט. הידבקות היא בשלב מפנה itial בעקום הקיבול (בין 2-8 HR). הפצת, שהוא ביחס ליניארי לכיסוי אלקטרודה, מיוצג על ידי שיפוע העקום, והוא הושלם לאחר שעה 10-30 בהתאם לצפיפות הזריעה. הזמן לא נקודה 1/2 (כיסוי חצי מקסימאלי) יכול לשמש לניתוח סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4. אפיון של המחסום ומחוברות. שני תורמי MVEC עם מספרים שונים מעבר (מעבר 3 ו -6) היו זורעים על מערכי 8W1E ג'לטין מצופים ומדידת MFT בוצעה עבור 30 שעות כדי לאפיין את מחסום EC.) התנגדות מדידות מראות כי יש לו את התורם הצעיר 1 התנגדות גבוהה יותר של CA. 11,000 Ω בהשוואה לקליפורניה. 7,500 Ω של התורם המבוגר יותר 2. לפנה"ס) יכולות הדוגמנות של ECIS היה בשימוש כדי למצוא את הסיבה להתנגדות נמוכה יותר. דוגמנות חשפה Rb אינטראקציה תאי תאים דומה והצביעה על אינטראקציה של תאי מטריצה ​​מוחלשת אלפא כגורם אפשרי. ד) RTC בוצע לכמת micromotion בתוך שכבת תאי מחוברות ידי שינוי פורייה, שבו השטח מתחת לעקומה הוא פרופורציונלי לmicromotion . ניתוח של הספקטרום מראה פחות micromotion של התורם המבוגר 2 ובכך לתמוך במה שכבר ניתן להניח מאות ההתנגדות (פחות שונות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 5 "עבור: תוכן width =" 5in "עבור: src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/> איור 5. נדידת תאים לאחר פציעה ואת השפעות של גירוי תרומבין חשמליים. הקלטות עכבה בוצעו ב 4 קילוהרץ עם רזולוציה של זמן מקסימאלי. תורם) MVEC 1 שימש בחלוף 3 ותורם 2 בקטע 6 על מערכי 8W1E ג'לטין מצופים ומבוגר כדי מפגש. לאחר מכן פצע חשמלי נוצר על ידי יישום של שתי 5 V פעימות ב kHz 60 עם משך זמן של 20 שניות כל אחד. התורם הצעיר 1 הראה פצע טוב יותר ריפוי יכולות המבוססות על סגירה מהירה יותר בסופו (הגירה, מדרונות של העקומות) ועמידות גבוהה יותר לאחר פציעתם בהשוואה לתורם המבוגר יותר 2. B) HUVEC גדל על מערכי 8W10E ג'לטין מצופים. על מפגש התאים כבר בסרום רעב ל1.5 שעות על ידי החלפת מדיום התרבות השלמה עם מדיום בסיסי בתוספת 1% אלבומין בסרום אדם (HSA). לנוגיל בינוני רגיל עם HSA הוא שלב קריטי, שכן מרכיבי סרום לחסום את התגובה של תרומבין. ברגע שרמת התנגדות יציבה זוהתה, תרומבין נוספו ישירות לבארות וערבב בזהירות עם טפטפת μl 200. השפעת תרומבין המקסימלי גלויה לאחר 30 דקות, המתאפיינות בירידה זמנית בהתנגדות לתחילת מחקר ובקליפורניה. התנגדות 30-50% נמוכה יותר לאחר החלמה. התאים היו preincubated או עם קינאז חוסם Y-27632 Rho ל30 דקות או חוסם נוספו 20, 30, או 40 דקות אחרי תוספת תרומבין, אשר הפחיתו את אפקט תרומבין באופן מיידי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של דמות זו .